Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ustawienia materiału
- Inkubować jaja piskląt w dostępnym w handlu inkubatorze stołowym w temperaturze 37 °C. Inkubować jaja przez 7 dni w przypadku zarodków E7.
- Przygotuj matryce wieloelektrodowe (MEA). Wysterylizuj wymaganą liczbę MEA, mocząc je w 70% etanolu przez 3 do 4 godzin, a następnie trzykrotnie płucząc w około 10 ml sterylnej wody destylowanej w okapie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego II (BSLII).
nuta: MEA zawierają 64 nanoporowate elektrody platynowe ułożone w siatkę 8 x 8. Średnica elektrody wynosi 30 μm, a odstęp między elektrodami wynosi 200 μm. Nie używaj denaturowanego etanolu do sterylizacji MEA, ponieważ doprowadzi to do korozji.
- Umieść MEA w sterylnym pojemniku z pokrywką (w celu utrzymania sterylnych warunków) i przenieś do inkubatora stołowego. Piecz przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 55 °C. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej sterylizacji, a temperatura nie powinna przekraczać 60 °C. Aby zachować sterylność, przenieś naczynie zawierające MEA do okapu BSLII w celu przechowywania do czasu dalszego użycia.
nuta: Używamy szklanego naczynia do pieczenia nadającego się do pieczenia w piekarniku z plastikową pokrywką i sterylizujemy je powierzchniowo 70% etanolem i umieszczamy w okapie BSLII do wysuszenia.
- Podwielokrotnić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Rozmrozić fiolkę w temperaturze 4 °C przez noc i zamrozić 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
nuta: ECM jest wysyłany w stanie zamrożonym. Nie należy go doprowadzać do temperatury pokojowej, dopóki nie będzie gotowy do powlekania, ponieważ polimeryzuje w temperaturze pokojowej i nie można go pokryć po polimeryzacji. ECM bez czynników wzrostu jest preferowany, aby zapobiec dodatkowym skutkom spowodowanym nieznanymi czynnikami.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne (kleszcze Dumont #5, kleszcze zakrzywione, małe nożyczki i nożyczki sprężynowe) oraz samouszczelniające się naczynia preparacyjne pokryte materiałem 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia w okapie preparacyjnym
.
2. Hodowla neuronów embrionalnych piskląt i aktywność sieci
- W dniu posiewu wyjąć fiolkę ECM z zamrażarki o temperaturze -20 °C, spryskać 70% etanolem i umieścić na lodzie. Rozcieńczyć do 25%, dodając 300 μl zimnej pożywki neuropodstawowej do okapu BSLII.
- Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl 25% ECM do środka MEA, uważając, aby nie dotknąć elektrod i natychmiast usuń, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Przykryj MEA i umieść w inkubatorze CO2 (37 ° C i 5% CO2 ) do momentu, aż będą gotowe do płytki neuronów.
- Wysterylizować zewnętrzną skorupę jaja E7 (7. dzień zarodkowy, inkubowany w temperaturze 37 °C przez 7 dni) 70% etanolem. Odetnij zarodek do dolnego naczynia preparacyjnego Sylgarda zawierającego zimny sterylny roztwór zrównoważonych soli Hanka (HBSS) bez wapnia. Wytnij wokół oczu i usuń gałki oczne. Za pomocą cienkich kleszczyków DuMont #5 i nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie po stronie brzusznej i usuń zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę pial. Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego i pokrój je na małe kawałki o wielkości około 2 mm za pomocą nożyczek sprężynowych.
nuta: Po usunięciu błony mózgowia nie powinny być żadnych naczyń krwionośnych przyczepionych do przodomózgowia. Jeśli to możliwe, lepiej jest przeprowadzić sekcję w sterylnym kapturze preparacyjnym, chociaż uzyskaliśmy dość dobre wyniki, gdy sekcja jest wykonywana poza kapturem, o ile narzędzia i obszar sekcji są dokładnie wysterylizowane 70% etanolem.
- Za pomocą sterylnej pipety transferowej zbierz kawałki przodomózgowia do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i usuń jak najwięcej HBSS po pozostawieniu ich na dnie probówki wirówkowej.
- Dodać 1 ml 0,05% trypsyny/etylenodiaminy kwasu tetraoctowego (Trypsyna/EDTA) (wstępnie podgrzanego do 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
- Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usuń trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki i dodaj 1 ml podłoża neurobazalnego. Pozwól kawałkom tkanki opaść na dno i usuń podłoże. Powtórz to pranie jeszcze raz. Ten krok polega na zmyciu trypsyny/EDTA.
- Dodaj 2 ml pożywki neuropodstawowej i zacznij trytuować. Rozcieranie polega na pobraniu sterylnej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura i delikatnym przepuszczeniu przez nią tkanki kilka razy, aż nie będzie widać więcej kawałków. Jeśli po wielokrotnych przejściach pozostaną jakieś kawałki, po prostu pozostaw je do osiadania na dnie.
nuta: Unikaj spieniania podczas rozcierania - jeśli utworzy się piana, zatrzymaj się i usuń przez aspirację.
- Rozcieńczyć ponownie zawieszone komórki w stosunku 1:10 pożywką neurobazalną i policzyć żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru. Zmieszać 50 μl rozcieńczonych komórek z 50 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl do hemekytometru po umieszczeniu na szkiełku nakrywkowym i policzyć jasne, przezroczyste komórki (niebieskie komórki są martwe i nie powinny być liczone).
nuta: Typowa liczba komórek z pojedynczego czujnika optycznego E7 waha się od 1 do 5 x 107 komórek/ml.
- Płytkować zdysocjowane komórki na MEA pokrytych ECM o gęstości 2,200 komórek/mm kwadratowy. W przypadku naszego systemu MEA przekłada się to na około 130 000 komórek na MEA. Dodaj pożywkę neuropodstawną, aby zwiększyć objętość MEA do 1 ml i umieść MEA w inkubatorze CO2 na noc w celu przyłączenia komórek i przedłużenia neurytów (ryc. 1).
nuta: W przypadku MEA o różnych obszarach i liczbie elektrod można wypróbować różne gęstości komórek - ogólnie rzecz biorąc, wyższa gęstość komórek powoduje większą aktywność sieci, ale prowadzi również do krótszych hodowli.
