Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Podsumowanie

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Streszczenie

Systematyczna manipulacja mikrośrodowiskiem komórkowym z rozdzielczością mikro- i nanometryczną jest często niezbędna do wyjaśnienia różnych zjawisk komórkowych i molekularnych. Aby sprostać temu wymaganiu, opracowaliśmy technikę litografii plazmowej do manipulowania mikrośrodowiskiem komórkowym poprzez tworzenie powierzchni z wzorem o rozmiarach elementów od 100 nm do milimetrów. Celem tej techniki jest możliwość kontrolowanego badania zachowań pojedynczych komórek, jak również grup komórek oraz ich interakcji.

Ta metoda litografii plazmowej opiera się na selektywnej modyfikacji chemii powierzchni podłoża poprzez osłanianie kontaktu plazmy niskotemperaturowej za pomocą fizycznej formy. Takie selektywne osłanianie pozostawia wzór chemiczny, który może kierować przyleganiem i ruchem komórek. Wzór ten, czyli szablon powierzchniowy, może być następnie wykorzystany do tworzenia sieci komórek, których struktura może naśladować tę występującą w naturze, tworząc kontrolowane środowisko do badań eksperymentalnych. Technika ta dobrze nadaje się do badania zjawisk biologicznych, ponieważ w sposób biokompatybilny wytwarza stabilne wzory powierzchniowe na przezroczystych podłożach polimerowych. Wzory powierzchniowe utrzymują się od tygodni do miesięcy, dzięki czemu mogą kierować interakcjami z komórkami przez długi czas, co ułatwia badanie długoterminowych procesów komórkowych, takich jak różnicowanie i adaptacja. Modyfikacja powierzchni ma charakter przede wszystkim chemiczny, zatem nie wprowadza interferencji topograficznych ani fizycznych, które mogłyby zakłócić interpretację wyników. Proces tworzenia wzorów nie wymaga również stosowania agresywnych lub toksycznych substancji i jest kompatybilny z hodowlą tkanek. Co więcej, metodę tę można zastosować do modyfikacji różnych typów podłoży polimerowych, które dzięki możliwości dostrajania ich właściwości są idealne i szeroko stosowane w aplikacjach biologicznych. Osiągalna rozdzielczość jest również korzystna, ponieważ izolacja konkretnych procesów, takich jak migracja, adhezja czy wiązanie, pozwala na dyskretne i przejrzyste obserwacje na poziomie pojedynczych oraz wielu komórek.

Metoda ta była stosowana do tworzenia zróżnicowanych sieci różnych typów komórek w badaniach dotyczących migracji, sygnalizacji, formowania tkanek oraz zachowania i interakcji neuronów ułożonych w sieć.

Protokół

1. Tworzenie form używanych do wzorowania

1. Projekt koncepcyjny wzorów. Tworzone są wzory, które służą do formowania sieci komórkowych, kontrolowania kontaktu między komórkami, izolowania komórek, naśladowania struktur naturalnych lub w inny sposób kierowania adhezją i rozmieszczeniem komórek.
2. Tworzenie wzoru i fotomaski w oparciu o wspomaganie komputerowe lub CAD. Pożądany wzór jest projektowany w oprogramowaniu CAD, takim jak AutoCAD, a następnie wysyłany do zewnętrznej firmy w celu wykonania fotomaski.
3. Fotolitografia w celu wytworzenia wzoru matrycowego. Przeszkala są wzorowane przy użyciu cienkiego resistu pozytywowego lub grubego resistu negatywowego, w zależności od rozmiaru tworzonej struktury. Przeszkła są stosowane ze względu na niski koszt, większą wytrzymałość niż w przypadku wafli krzemowych oraz mniejszą ilość pyłu powstającego podczas ich stłuczenia. Alternatywnie, jako wzór matrycowy można wykorzystać inne odpowiednie struktury, takie jak siatki dyfrakcyjne.
4. Wzorowane szkło jest mocowane do stosu niepoddanych wzorowaniu szkieł. Wszystkie kroki są wykonywane wewnątrz czystej komory z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować zapylenie.
5. Tworzenie form matrycowych. Tworzony jest pojemnik z folii aluminiowej, nieco większy niż stos szkieł, aby pomieścić 30 g Polydimethylsiloxane (PDMS), który jest następnie wlewany na powierzchnię wzorowaną fotolitograficznie w celu stworzenia wstępnej formy. PDMS jest odgazowywany i utwardzany przez jeden do dwóch dni.
6. Po utwardzeniu PDMS jest odrywany od wzoru matrycowego, tworząc formę do kolejnego etapu.
7. Mieszana jest przez 1 minutę 6 g dwuskładnikowej żywicy epoksydowej (Devcon #14310(6 g)), a następnie wlewana do formy matrycowej, odgazowywana i utwardzana. Odgazowywanie żywicy epoksydowej musi być przeprowadzone szybko (<8 min), stosując wiele cykli pękających pęcherzyków i używając jedynie cienkiej warstwy, zanim żywica stężeje i usuwanie pęcherzyków stanie się niemożliwe. Użyte 6 g pozwala na uzyskanie cienkiej warstwy, co ułatwia szybkie usuwanie pęcherzyków.
8. Po jednej godzinie żywica epoksydowa będzie częściowo utwardzona i na jej wierzch można dodać więcej żywicy bez odgazowywania, aby uzyskać grubszą strukturę, która jest łatwiejsza w obsłudze w późniejszych etapach. Następnie żywica jest utwardzana przez jeden do dwóch dni.
9. Po utwardzeniu żywica epoksydowa jest usuwana z formy matrycowej PDMS, a wokół formy epoksydowej owijana jest taśma w celu utworzenia pojemnika. Następnie tworzona jest forma robocza poprzez wlanie PDMS na formę epoksydową, odgazowanie PDMS i utwardzanie przez jeden do dwóch dni.
10. Po utwardzeniu forma robocza jest odrywana od żywicy epoksydowej i przechowywana w celu zachowania czystości.

2. Wzorowanie powierzchni za pomocą form do kierowania wzrostem komórek

1. Wycinane są małe fragmenty formy roboczej i umieszcza się je na polistyrenowej płytce Petriego. Położenie tych fragmentów formy zostaje oznakowane.
2. Z małych fragmentów tworzy się konstrukcję przypominającą statyw, którą obciążono, aby zapewnić pełny kontakt formy roboczej z powierzchnią płytki Petriego. Prawidłowe rozmieszczenie można sprawdzić, patrząc na dno płytki.
3. Zestaw umieszcza się w komorze plazmowej. Rozpoczyna się i kontynuuje traktowanie plazmą powietrzną przy ciśnieniu 150 Pa i mocy 29,6 W (moc maksymalna) przez 10 minut.
4. Po traktowaniu plazmą usuwa się formę wraz z obciążeniem.
5. Płytkę Petriego umieszcza się pod światłem UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut w celu sterylizacji, a następnie przechowuje w niej do momentu wysiania komórek.

3. Wysiewanie komórek na powierzchnie

1. Komórki neuroblastoma ludzkiego SH-SY5Y CRL-2266 lub inne komórki są hodowane zgodnie ze standardowymi protokołami dla danego typu komórek.
2. Stopień konfluencji komórek neuroblastoma ludzkiego SH-SY5Y CRL-2266 jest oceniany wizualnie przed ich wysianiem na wzorcowaną powierzchnię.
3. Przeprowadza się standardowy pasaż komórek w celu ich odseparowania od powierzchni szalki Petriego.
4. Komórki po zawieszeniu w medium są rozcieńczane do stężenia pozwalającego na uzyskanie pożądanej konfluencji, a następnie wysiewa się je na powierzchnię wzorcowanej szalki Petriego.
5. Pozostawia się komórki do osiadania i przytwierdzenia do powierzchni.
6. Wzorcowaną szalkę Petriego inkubuje się od kilku godzin do kilku dni, podczas gdy komórki organizują się zgodnie ze wzorem stworzonym przez plazmę.
7. Podczas hodowli komórek neuroblastoma codziennie dodaje się kwas retinowy (10 μM), aby indukowć różnicowanie komórek do stanu neuronopodobnego. Dodawanie kwasu retinowego odbywa się w ciemności.
8. Kwas retinowy jest dodawany codziennie przez kilka dni, po czym różnicowanie staje się widoczne.
9. Pożywkę wymienia się co 3-4 dni.

4. Obserwacja i analiza

1. W celu obserwacji zachowania komórek w czasie wykonuje się okresowe obrazy lub nagrania wideo żywych komórek. W przypadku obrazowania żywych komórek, umieszcza się je w inkubatorze na stoliku mikroskopu, który utrzymuje temperaturę 37 °C, 100% wilgotności oraz 5% CO₂. Komórki mogą być również utrwalone i barwione w celu obserwacji w fluorescencji.
2. Przechwycone obrazy lub nagrania wideo komórek są importowane do systemu analizy obrazu, a następnie przeprowadza się pomiary, obejmujące m.in. tempo wzrostu, wielkość komórek, prędkość migracji, różnicowanie, orientację, lokalizację specyficznych białek i inne parametry.

5. Reprezentatywne wyniki:

Typowym rezultatem zastosowania techniki litografii plazmowej jest utworzenie wzoru komórek przypominającego dowolną lub naturalną strukturę. Przedstawiono to na Rysunku 1a-b, gdzie stworzono linie i sieci neuronów. Można wykorzystać również inne typy komórek, co pokazano na Rysunku 1c-d, na którym widoczne są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) oraz komórki mięśni szkieletowych C2C12 tworzące siatki. Możliwe jest również nadawanie wzorów materiałom takim jak poli-l-lizyna, Rysunek 1e, aby ułatwić przywieranie określonych typów komórek oraz w innych zastosowaniach. W przypadku pokazanych neuronów stworzono sieci komórek posiadających wzajemne połączenia. Odzwierciedla to procesy zachodzące naturalnie w mózgu, gdzie neurony mają dyskretne połączenia między sąsiadującymi komórkami, co wpływa na funkcjonowanie mózgu. Dzięki stworzeniu takiej struktury w laboratorium liczba, położenie, częstotliwość i inne czynniki dotyczące połączeń mogą być systematycznie kontrolowane. Wyniki tych układów można mierzyć wizualnie, a w celu zbadania zachowania sieci można zastosować dodatkowe bodźce, takie jak stymulacja chemiczna lub elektryczna.

Wynikiem negatywnym byłby wzór z przerostem lub niepełny, a także skażona próbka. Niepełny lub przerośnięty wzór wynikałby z zasiałem na podłożu zbyt małej lub zbyt dużej liczby komórek, co nie zapewniłoby wzorowi optymalnej liczby komórek. Ponadto, jeśli wzór nie został zaprojektowany prawidłowo (np. linie są zbyt wąskie), komórki nie będą w stanie skutecznie przytwierdzić się do niego i rosnąć. W przypadku skażonej próbki oznacza to, że podczas jednego z etapów nie zachowano odpowiedniej czystości, choć zdarza się to rzadko przy przestrzeganiu właściwego protokołu hodowli komórkowej, ponieważ wzorowanie plazmowe jednocześnie sterylizuje podłoże.

Rysunek 1. Wzorowanie komórek i białek.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda badania komórek umożliwia tworzenie złożonych wzorów wielokomórkowych sieci naśladujących struktury biologiczne, a także dostarcza sposobu generowania bodźców o charakterze subkomórkowym, co ułatwia badania zachowania grup komórek oraz odpowiedzi pojedynczych komórek na czynniki środowiskowe. Zastosowanie tej metody jest proste, a zarazem niezawodne, ponieważ można ją szybko przeprowadzić przy użyciu niedrogiego sprzętu w tym samym laboratorium, w którym prowadzona jest hodowla komórkowa. Metoda ta wykazuje również wysoką wrażliwość komórkową, pozwala na łatwą obserwację wynikowego zachowania i jest z natury stabilna przez długi czas, co umożliwia badanie długoterminowego zachowania komórek. Dodatkowo pozwala ona na przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów, ponieważ jest kompatybilna z wieloma typami komórek i umożliwia tworzenie dowolnych wzorów. Długoterminowa stabilność tej techniki wynika z faktu, że funkcjonalizacja powierzchni nadana przez plazmę jest integralną częścią powierzchni, a nie powłoką lub inną warstwą, która mogłaby zostać usunięta lub ulec degradacji. W warunkach zanurzenia w cieczy tego typu modyfikacja może zachować zdolność kierowania komórkami przez wiele miesięcy.

Najbardziej krytyczną częścią eksperymentu, niezbędną do zapewnienia wiarygodnych wyników, jest stworzenie wzorca głównego, który zostanie ostatecznie wykorzystany do kierowania wzrostem komórek. Jeśli wzorzec ten nie zostanie odpowiednio zaprojektowany, komórki nie zareagują na niego w prawidłowy sposób i mogą nie wykazać pożądanej aktywności. Parametry takie jak szerokość linii, odstępy między elementami wzoru i inne mogą w znacznym stopniu wpływać na kompatybilność komórek z konkretnym wzorcem; zazwyczaj na początkowej fotomase tworzy się zakres takich parametrów, aby wyłonić najbardziej odpowiedni projekt.

Inne ważne parametry związane z wykonywaniem wzorowania obejmują tworzenie formy, utrzymanie środowiska wolnego od pyłu, wysiew komórek oraz ogólną sterylność hodowli komórkowej. Tworzenie formy może być realizowane poprzez różne etapy przenoszenia, które przeprowadza się, aby umożliwić wielokrotne odlewanie PDMS z formy epoksydowej. Formę epoksydową tworzy się dlatego, że nie ulega ona takiej degradacji jak forma z fotorezystu z małymi strukturami o wysokim współczynniku kształtu podczas wielokrotnego odlewania. Jeśli formowanie transferowe zostanie wykonane prawidłowo, wymiary i wydajność nie zostaną zmienione, natomiast w przypadku błędów, takich jak niewłaściwe odgazowanie, niepełne utwardzanie lub nadmierne nagrzewanie, mogą pojawić się pęcherzyki, chropowatość i deformacja wzoru, co wpływa na końcowy rezultat. W odniesieniu do utrzymania środowiska wolnego od pyłu, formy muszą być utrzymywane w jak największej czystości, ponieważ każdy pył może zakłócić prawidłowy kontakt między roboczą formą PDMS a powierzchnią, a tym samym prawidłowe ekranowanie plazmą i wzorowanie chemiczne. Gęstość wysiewu komórek również musi być zoptymalizowana, aby zapewnić, że w obszarze wzoru nie znajdzie się zbyt mało ani zbyt wiele komórek, a sterylność musi być zachowana, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami i innymi czynnikami komórek wykorzystywanych w badaniu.

Technikę tę można również połączyć z innymi elementami, takimi jak mikroprzepływy, mikroelektrody i sondy mechaniczne. Pozwala to na dostarczenie komórkom dodatkowych bodźców w celu lepszego odwzorowania różnych warunków fizjologicznych podczas eksperymentów, a przyszłe prace skupią się na badaniu efektów tych kombinacji

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczacz plazmowy i komora próżniowa	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny i fazowo-kontrastowy	Instrumenty Nikon	TE2000-U
Inkubator na stolik mikroskopu	AmScope	Model TCS-100	Zmodyfikowany w celu dołączenia komory zapewniającej odpowiednią atmosferę
szalka Petri z polistyrenu	VWR international	25384-090
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Żywica epoksydowa	Devcon Inc.	2 t przejrzysta żywica epoksydowa #14310
Pożywki do hodowli komórkowych	Różnorodne		Pożywki są sporządzane zgodnie ze standardowymi recepturami dla danego typu komórek
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	R2625