Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Podsumowanie

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Streszczenie

Systematyczna manipulacja mikrośrodowiskiem komórkowym z rozdzielczością mikro- i nanometryczną jest często niezbędna do wyjaśnienia różnych zjawisk komórkowych i molekularnych. Aby sprostać temu wymaganiu, opracowaliśmy technikę litografii plazmowej do manipulowania mikrośrodowiskiem komórkowym poprzez tworzenie powierzchni z wzorem o rozmiarach elementów od 100 nm do milimetrów. Celem tej techniki jest możliwość kontrolowanego badania zachowań pojedynczych komórek, jak również grup komórek oraz ich interakcji.

Ta metoda litografii plazmowej opiera się na selektywnej modyfikacji chemii powierzchni podłoża poprzez osłanianie kontaktu plazmy niskotemperaturowej za pomocą fizycznej formy. Takie selektywne osłanianie pozostawia wzór chemiczny, który może kierować przyleganiem i ruchem komórek. Wzór ten, czyli szablon powierzchniowy, może być następnie wykorzystany do tworzenia sieci komórek, których struktura może naśladować tę występującą w naturze, tworząc kontrolowane środowisko do badań eksperymentalnych. Technika ta dobrze nadaje się do badania zjawisk biologicznych, ponieważ w sposób biokompatybilny wytwarza stabilne wzory powierzchniowe na przezroczystych podłożach polimerowych. Wzory powierzchniowe utrzymują się od tygodni do miesięcy, dzięki czemu mogą kierować interakcjami z komórkami przez długi czas, co ułatwia badanie długoterminowych procesów komórkowych, takich jak różnicowanie i adaptacja. Modyfikacja powierzchni ma charakter przede wszystkim chemiczny, zatem nie wprowadza interferencji topograficznych ani fizycznych, które mogłyby zakłócić interpretację wyników. Proces tworzenia wzorów nie wymaga również stosowania agresywnych lub toksycznych substancji i jest kompatybilny z hodowlą tkanek. Co więcej, metodę tę można zastosować do modyfikacji różnych typów podłoży polimerowych, które dzięki możliwości dostrajania ich właściwości są idealne i szeroko stosowane w aplikacjach biologicznych. Osiągalna rozdzielczość jest również korzystna, ponieważ izolacja konkretnych procesów, takich jak migracja, adhezja czy wiązanie, pozwala na dyskretne i przejrzyste obserwacje na poziomie pojedynczych oraz wielu komórek.

Metoda ta była stosowana do tworzenia zróżnicowanych sieci różnych typów komórek w badaniach dotyczących migracji, sygnalizacji, formowania tkanek oraz zachowania i interakcji neuronów ułożonych w sieć.

Protokół

1. Tworzenie form wykorzystywanych do wzorcowania

1. Projekt koncepcyjny wzorów. Tworzone są wzory, które służą do formowania sieci komórkowych, kontrolowania kontaktu między komórkami, izolowania komórek, naśladowania struktur naturalnych lub w inny sposób kierowania adhezją i rozmieszczeniem komórek.
2. Tworzenie wzoru i fotomaski w oparciu o projekt wspomagany komputerowo (CAD). Pożądany wzór jest projektowany w oprogramowaniu CAD, takim jak AutoCAD, a następnie wysyłany do zewnętrznej firmy w celu wykonania fotomaski.
3. Fotolitografia w celu wytworzenia wzorca głównego. Płytki szklane są wzorowane przy użyciu cienkiego resistu pozytywowego lub grubego resistu negatywowego, w zależności od rozmiaru tworzonej struktury. Płytki szklane stosuje się ze względu na niski koszt, większą wytrzymałość niż w przypadku wafli krzemowych oraz mniejszą ilość pyłu powstającego przy ich stłuczeniu. Alternatywnie, jako wzorzec główny można wykorzystać inne odpowiednie struktury, takie jak siatki dyfrakcyjne.
4. Wzorowana płytka zostaje przytwierdzona do stosu płytek, które nie zostały wzorowane. Wszystkie kroki są wykonywane wewnątrz kaptura z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować ilość kurzu.
5. Tworzenie form głównych. Tworzony jest pojemnik z folii aluminiowej, nieco większy niż stos płytek, aby pomieścić 30 g polidimetylosiloksanu (PDMS), który następnie jest wlewany na powierzchnię wzorowaną fotolitograficznie w celu stworzenia wstępnej formy. PDMS jest odgazowany i pozostawiony do utwardzenia przez jeden do dwóch dni.
6. Po utwardzeniu PDMS jest odrywany od wzorca głównego i tworzy formę do kolejnego etapu.
7. Mieszany przez 1 minutę 6 g dwuskładnikowej żywicy epoksydowej (Devcon #14310(6 g)), a następnie wlewa się ją do formy głównej, odgazowuje i pozostawia do utwardzenia. Odgazowywanie żywicy epoksydowej musi być przeprowadzone szybko (<8 min) przy użyciu wielu cykli usuwania pęcherzyków powietrza i przy zastosowaniu jedynie cienkiej warstwy, zanim żywica stężeje i usunięcie pęcherzyków stanie się niemożliwe. Użycie 6 g pozwala na uzyskanie cienkiej warstwy, co ułatwia szybkie usuwanie pęcherzyków.
8. Po godzinie żywica epoksydowa będzie częściowo utwardzona i na wierzch można dodać więcej żywicy bez odgazowywania, aby uzyskać grubszą strukturę, która jest łatwiejsza w obsłudze w późniejszych krokach. Żywica jest następnie pozostawiona do utwardzenia przez jeden do dwóch dni.
9. Po utwardzeniu żywica epoksydowa jest usuwana z głównej formy PDMS, a wokół formy epoksydowej owija się taśmę, aby stworzyć pojemnik. Następnie tworzy się formę roboczą poprzez wlanie PDMS na formę epoksydową, odgazowanie PDMS i utwardzanie przez jeden do dwóch dni.
10. Po utwardzeniu forma robocza jest odrywana od żywicy epoksydowej i przechowywana w celu zachowania czystości.

2. Wzorcowanie powierzchni za pomocą form do prowadzenia komórek

1. Wycinane są niewielkie fragmenty formy roboczej i umieszczane na polistyrenowej szalce Petriego. Pozycje tych fragmentów formy zostają oznakowane.
2. Z niewielkich fragmentów tworzy się statyw, który następnie obciążone, aby zapewnić przyleganie formy roboczej do powierzchni szalki Petriego. Prawidłowe rozmieszczenie można zweryfikować, patrząc na dno szalki.
3. Zestaw zostaje umieszczony w komorze plazmowej. Rozpoczyna się i kontynuuje proces traktowania plazmą powietrzną przy ciśnieniu 150 Pa i mocy 29,6 W (moc maksymalna) przez 10 minut.
4. Po traktowaniu plazmą wyjmuje się formę wraz z obciążnikami.
5. Szalkę Petriego umieszcza się pod światłem UV w komorze bezpiecznej dla biologii na 10 minut w celu sterylizacji, a następnie przechowuje w niej do czasu zasiewu komórek.

3. Wysiewanie komórek na powierzchnie

1. Komórki neuroblastoma ludzkiego SH-SY5Y CRL-226 lub inne linie komórkowe są hodowane zgodnie ze standardowymi protokołami dla danego typu komórek.
2. Przed wysianiem na wzorzec naniesiony na powierzchnię, stopień konfluencji komórek neuroblastoma ludzkiego SH-SY5Y CRL-26 jest oceniany wizualnie.
3. Przeprowadzane jest standardowe pasażowanie w celu odzyskania komórek z powierzchni szalki Petriego.
4. Komórki po uwolnieniu do zawiesiny są rozcieńczane w celu uzyskania pożądanej konfluencji po wysianiu na powierzchnię szalki Petriego z naniesionym wzorcem.
5. Komórki pozostawia się do czasu ich osiadania i przytwierdzenia do powierzchni.
6. Szalkę Petriego z naniesionym wzorcem inkubuje się od kilku godzin do kilku dni, podczas gdy komórki organizują się zgodnie ze wzorcem stworzonym przez plazmę.
7. Podczas hodowli komórek neuroblastoma codziennie dodaje się kwas retinowy (10 μM) w celu indukcji różnicowania komórek do stanu neuronopodobnego. Dodawanie kwasu retinowego odbywa się w ciemności.
8. Kwas retinowy jest dodawany codziennie przez kilka dni, po czym widoczne staje się różnicowanie.
9. Pożywkę wymienia się co 3-4 dni.

4. Obserwacja i analiza

1. Wykonuje się okresowe obrazy lub nagrania wideo żywych komórek, aby obserwować ich zachowanie w czasie. W przypadku obrazowania żywych komórek, są one umieszczone w inkubatorze na stoliku mikroskopu, który utrzymuje temperaturę 37 °C, 10% wilgotności oraz 5% CO₂. Komórki mogą być również utrwalane i barwione w celu obserwacji w fluorescencji
2. Przechwycone obrazy lub nagrania wideo komórek są importowane do systemu analizy obrazu, a następnie wykonuje się pomiary, w tym szybkość wzrostu, wielkość komórek, prędkość migracji, różnicowanie, orientację, lokalizację specyficznych białek i inne parametry.

5. Reprezentatywne wyniki:

Typowym wynikiem zastosowania techniki litografii plazmowej jest utworzenie wzoru komórek przypominającego dowolną lub naturalną strukturę. Przedstawiono to na Rysunku 1a-b, gdzie stworzono linie i sieci neuronów. Można wykorzystać również inne typy komórek, co pokazano na Rysunku 1c-d, gdzie ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) oraz komórki mięśni szkieletowych C2C12 tworzą siatki. Można również tworzyć wzory z materiałów takich jak poli-l-lizyna, Rysunek 1e, aby ułatwić przyleganie określonych typów komórek lub w innych celach. W przypadku przedstawionych neuronów stworzono sieci komórek posiadających wzajemne połączenia. Odzwierciedla to procesy zachodzące naturalnie w mózgu, gdzie neurony mają dyskretne połączenia między sąsiadującymi komórkami, co wpływa na funkcjonowanie mózgu. Dzięki stworzeniu takiej struktury w laboratorium można systematycznie kontrolować liczbę, położenie, częstotliwość oraz inne czynniki dotyczące tych połączeń. Wyniki takich układów można ocenić wizualnie, a w celu zbadania zachowania sieci można zastosować dodatkowe bodźce, takie jak stymulacja chemiczna lub elektryczna.

Wynikiem negatywnym byłby wzór przerośnięty lub niekompletny bądź zanieczyszczona próbka. Niekompletny lub przerośnięty wzór byłby wynikiem wysiania na podłożu zbyt małej lub zbyt dużej liczby komórek, co nie zapewniłoby wzorowi optymalnej gęstości komórek. Ponadto, jeśli wzór nie zostanie zaprojektowany prawidłowo (np. linie będą zbyt wąskie), komórki nie będą w stanie skutecznie do niego przywrzeć i rosnąć. W przypadku zanieczyszczonej próbki oznaczałoby to brak zachowania odpowiedniej czystości podczas jednego z etapów, choć zdarza się to rzadko przy stosowaniu właściwych protokołów hodowli komórkowych, ponieważ wzorowanie plazmą sterylizuje również podłoże.

Rycina 1. Wzorowanie komórek i białek.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda badania komórek umożliwia tworzenie złożonych wzorów wielokomórkowych sieci naśladujących struktury biologiczne, a także dostarcza sposobu generowania bodźców o charakterze subkomórkowym, co ułatwia badania zachowania grup komórek oraz odpowiedzi pojedynczych komórek na czynniki środowiskowe. Zastosowanie tej metody jest proste, a zarazem niezawodne, ponieważ można ją szybko przeprowadzić przy użyciu niedrogiego sprzętu w tym samym laboratorium, w którym prowadzona jest hodowla komórkowa. Metoda ta wykazuje również wysoką wrażliwość komórkową, pozwala na łatwą obserwację wynikowego zachowania i jest z natury stabilna przez długi czas, co umożliwia badanie długoterminowego zachowania komórek. Dodatkowo pozwala ona na przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów, ponieważ jest kompatybilna z wieloma typami komórek i umożliwia tworzenie dowolnych wzorów. Długoterminowa stabilność tej techniki wynika z faktu, że funkcjonalizacja powierzchni nadana przez plazmę jest integralną częścią powierzchni, a nie powłoką lub inną warstwą, która mogłaby zostać usunięta lub ulec degradacji. W warunkach zanurzenia w cieczy tego typu modyfikacja może zachować zdolność kierowania komórkami przez wiele miesięcy.

Najbardziej krytyczną częścią eksperymentu, niezbędną do zapewnienia wiarygodnych wyników, jest stworzenie wzorca głównego, który zostanie ostatecznie wykorzystany do kierowania wzrostem komórek. Jeśli wzorzec ten nie zostanie odpowiednio zaprojektowany, komórki nie zareagują na niego w prawidłowy sposób i mogą nie wykazać pożądanej aktywności. Parametry takie jak szerokość linii, odstępy między elementami wzoru i inne mogą w znacznym stopniu wpływać na kompatybilność komórek z konkretnym wzorcem; zazwyczaj na początkowej fotomase tworzy się zakres takich parametrów, aby wyłonić najbardziej odpowiedni projekt.

Inne ważne parametry związane z wykonywaniem wzorowania obejmują tworzenie formy, utrzymanie środowiska wolnego od pyłu, wysiew komórek oraz ogólną sterylność hodowli komórkowej. Tworzenie formy może być realizowane poprzez różne etapy przenoszenia, które przeprowadza się, aby umożliwić wielokrotne odlewanie PDMS z formy epoksydowej. Formę epoksydową tworzy się dlatego, że nie ulega ona takiej degradacji jak forma z fotorezystu z małymi strukturami o wysokim współczynniku kształtu podczas wielokrotnego odlewania. Jeśli formowanie transferowe zostanie wykonane prawidłowo, wymiary i wydajność nie zostaną zmienione, natomiast w przypadku błędów, takich jak niewłaściwe odgazowanie, niepełne utwardzanie lub nadmierne nagrzewanie, mogą pojawić się pęcherzyki, chropowatość i deformacja wzoru, co wpływa na końcowy rezultat. W odniesieniu do utrzymania środowiska wolnego od pyłu, formy muszą być utrzymywane w jak największej czystości, ponieważ każdy pył może zakłócić prawidłowy kontakt między roboczą formą PDMS a powierzchnią, a tym samym prawidłowe ekranowanie plazmą i wzorowanie chemiczne. Gęstość wysiewu komórek również musi być zoptymalizowana, aby zapewnić, że w obszarze wzoru nie znajdzie się zbyt mało ani zbyt wiele komórek, a sterylność musi być zachowana, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami i innymi czynnikami komórek wykorzystywanych w badaniu.

Technikę tę można również połączyć z innymi elementami, takimi jak mikroprzepływy, mikroelektrody i sondy mechaniczne. Pozwala to na dostarczenie komórkom dodatkowych bodźców w celu lepszego odwzorowania różnych warunków fizjologicznych podczas eksperymentów, a przyszłe prace skupią się na badaniu efektów tych kombinacji

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczacz plazmowy i komora próżniowa	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny i fazowo-kontrastowy	Instrumenty Nikon	TE2000-U
Inkubator na stolik mikroskopu	AmScope	Model TCS-100	Zmodyfikowany w celu dołączenia komory zapewniającej odpowiednią atmosferę
szalka Petri z polistyrenu	VWR international	25384-090
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Żywica epoksydowa	Devcon Inc.	2 t przejrzysta żywica epoksydowa #14310
Pożywki do hodowli komórkowych	Różnorodne		Pożywki są sporządzane zgodnie ze standardowymi recepturami dla danego typu komórek
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	R2625