$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Generowanie neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC (iNPC)
- Wyprodukuj sfery EZ z kolonii iPSC, jak opisano poniżej i jak wcześniej opublikowano.
- Hodowla kolonii iPSC do konfluencji na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej (0,5 mg / płytkę) w mTESR1 lub innych pożywkach komercyjnych (patrz tabela materiałów).
- Usuń pożywkę iPSC i zastąp ją 2 ml pożywki EZ-sphere [ESM; DMEM: F12 7:3 uzupełniony o 100 ng / ml zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), 100 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu, 5 μg / ml heparyny i 2% suplement B27].
- Zeskrobać dno każdej studzienki zlewającej się grzbietem sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1000 μl lub skrobaka do komórek.
- Zbierz wszystkie komórki i umieść je w kolbie T25 o bardzo niskim nasadce, aby umożliwić spontaniczne tworzenie swobodnie unoszących się kulek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Podawaj kulki co 2-3 dni, gdy podłoże zmieni kolor na żółty, zastępując połowę pożywki świeżym ESM. Pozwala to kulom pozostać w kondycjonowanym podłożu, co jest bardzo ważne dla ich wzrostu i utrzymania.
- Oprzyj kolbę na stojaku na probówki i pozwól kulkom osiąść grawitacyjnie przez 1-2 minuty w dół do rogu kolby.
- Po ustabilizowaniu się należy odessać połowę supernatantu za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub 10 ml i zastąpić ją świeżym, wstępnie podgrzanym ESM.
- Przepustka EZ-sfer co tydzień poprzez rozdrabnianie kulek do średnicy 200 μm, jak opisano wcześniej. Sfery EZ mogą być utrzymywane przez maksymalnie 25 przejść i są idealne, gdy są używane między przejściami 8–25.
- Przygotuj jednokomórkową zawiesinę iNPC:
- Aby wywołać różnicowanie neuronalne, zdysocjuj sferę EZ na pojedyncze komórki.
- Zbierz kulki 3-4 dni po rozdrobnieniu z kolby T75 i przenieś je do stożkowego o pojemności 15 ml, a następnie odstaw na 2 minuty lub do momentu, gdy wszystkie kulki osiądą.
- Powoli usuwaj ESM za pomocą pipety o pojemności 5 ml, nie naruszając osadzonych kulek. Dodać 1 ml roztworu dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Zamieszaj roztwór dysocjacyjny i kulki po 5 minutach inkubacji, aby upewnić się, że wszelkie osadzone kulki są traktowane.
- Powoli usuń roztwór dysocjacyjny. Dodać 1 ml pożywki do różnicowania neuronalnego [NDM; DMEM: F12 z 2% B27 minus witamina A, 1% suplement N2 i ludzki czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (hBDNF, 20 ng / ml)].
- Rozdzielić kulki na pojedyncze komórki, pipetując za pomocą pipety o pojemności 1 ml, a następnie pipety o pojemności 200 μl, aż wszystkie kulki zostaną rozdzielone. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas procedury rozcierania.
- Policz zdysocjowane komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczone komórki do końcowej gęstości 1 x 106 komórek/ml. Możliwa jest zmiana gęstości w zależności od zastosowania.
nuta: Wyższe gęstości (do 6 x 106 komórek/ml) są zalecane do krótkotrwałych hodowli do 3 dni, a niższe gęstości są zalecane do długotrwałych zastosowań do 3 tygodni.
nuta: Komórki są teraz gotowe do zasiania w górnym kanale chipa, aby utworzyć "stronę mózgu".
2. Różnicowanie iPSC na iBMEC
- Przejście iPSC z pojedynczej studzienki konfluentnej płytki 6-dołkowej w stosunku 1:6 do 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej. Pozwól komórkom przylegać przez 24 godziny. Codziennie zmieniaj pożywkę iPSC.
- Licz komórki codziennie za pomocą hemocytometru.
- Gdy komórki osiągną gęstość 1,5–3,0 x 105 komórek/studzienkę, zastąp pożywkę iPSC 3 ml niekondycjonowanej pożywki bez bFGF [DMEM:F12 1:1, z 10% zamiennikiem surowicy nokautującej (KOSR), 1% aminokwasami endogennymi (NEAA), 0,5% suplementem glutaminy (tabela materiałów) i 100 μM β-merkaptoetanolu]. Wymieniaj podłoże codziennie przez 6 dni.
- W 6 dniu zastąp pożywkę pożywką z komórek śródbłonka (EC) [pożywka wolna od ludzkiej surowicy śródbłonka (hESFM) uzupełniona 1% surowicą bydlęcą pochodzącą z ubogich w płytki krwi, 20 ng/ml bFGF i 10 μM kwasu all-trans-retinowego (RA)]. Pozostaw podłoże na 2 dni.
- Usunąć pożywkę EC i dodać 1 ml roztworu dysocjacyjnego do studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 35 min.
nuta: Chociaż uważa się, że jest to długi czas inkubacji w zastosowanym tutaj roztworze dysocjacyjnym, iBMEC mogą znieść to leczenie z żywotnością komórek wyższą niż 90%.
- Odłączyć komórki od studzienki, delikatnie pipetując zawiesinę komórek i zbierając wszystkie komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
nuta: Unikaj ostrego pipetowania. Jeśli komórki nie odłączają się łatwo, inkubuj przez dodatkowe 5 minut.
- Dodać 1 objętość pożywki EC do 15 ml pożywki stożkowej w celu dezaktywacji Accutase, odwirować przy 200 x g przez 5 minut, usunąć pożywkę i zastąpić ją 1 ml pożywki EC (bez bFGF i RA).
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj gęstość komórek do 14–20 x 106 komórek/ml.
nuta: Komórki są teraz gotowe do zasiania w dolnym kanale chipa, aby utworzyć "stronę krwi".
3. Mikrofabrykacja chipa narządu
- Użyj chipa narządowego do modelu chipa BBB i jego produkcji, jak to zrobiono wcześniej. Chip narządu wysokiego kanału (patrz tabela materiałów) jest wykonany z wysoce elastycznego elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS), który zawiera dwa nałożone na siebie i równoległe kanały w mikroskali oddzielone elastyczną porowatą membraną. Rozmiary górnych i dolnych mikrokanalików wynoszą odpowiednio 1 mm x 1 mm i 1,0 mm x 0,2 mm. Dwa kanały są oddzielone elastyczną porowatą membraną o grubości 50 μm, wykonaną przez PDMS, zawierającą pory o średnicy 7 μm w odstępach 40 μm. Powierzchnia porowatej membrany oddzielającej kanały wynosi 0,171cm2.
4. Przygotowanie żetonów
- Chipy narządowe są dostarczane w opakowaniu fabrycznie umieszczonym w nośniku na wióry, co eliminuje potrzebę zakłócania lub zniekształcania ustawienia chipa podczas przenoszenia. Ponadto nośnik chipów łączy się bezpiecznie z przenośnym modułem ("Pod"), który działa jako interfejs między modułem hodowli a chipem.
- Spryskaj opakowanie chipsów 70% etanolem i wprowadź je do szafy bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
- Otwórz opakowanie i ułóż chip narządu na sterylnej szalce Petriego. Nośnik wiórów należy obsługiwać tylko po bokach, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z wiórem.
- Upewnij się, że zaczep nośnika jest skierowany w prawo (Rysunek 1), a w przypadku korzystania z wielu chipów wyrównaj je wszystkie w tej samej orientacji.
- Oznacz każdy chip na karcie nośnej (pełne przygotowanie chipa i przebieg pracy pokazano na rysunku 2).
5. Aktywacja powierzchniowa i powłoka ECM
- Przygotowanie roztworu do aktywacji powierzchni
- Odczynnik Emulate 1 (ER-1), znajdujący się w fiolce zawierającej 5 mg, jest wrażliwy na światło. Przygotować świeży roztwór ER-1 bezpośrednio przed użyciem. Integralność ER-1 ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego przygotowania chipów.
- Wyłącz lampkę w BSC podczas obsługi ER-1.
nuta: ER-1 działa drażniąco na oczy i musi być obsługiwany w BSC w odpowiednich rękawicach i ochronie oczu.
- Przed użyciem pozwól, aby odczynniki ER-1 i ER-2 zrównoważyły się do temperatury pokojowej (RT).
- Chronić roztwór przed światłem, owijając pustą sterylną stożkową probówkę o pojemności 15 ml folią.
- W BSC krótko postukać w fiolkę ER-1, aby osadzić proszek na dnie.
- Dodać 1 ml buforu ER-2 do fiolki i natychmiast przenieść jego zawartość na dno owiniętej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Nie używać pipety do mieszania. Kolor roztworu przeniesionego do stożkowej rurki będzie czerwony.
- Powtórz krok 5.1.6 3 razy. W ostatniej rundzie zakręć fiolkę ER-1 i odwróć, aby zebrać pozostały proszek z pokrywki, a następnie przenieś roztwór do stożkowej probówki; spowoduje to zwiększenie całkowitej objętości do 4 ml roztworu ER-1.
- Dodać 6 ml roztworu ER-2 do 4 ml roztworu ER-1 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml do końcowego stężenia 0,5 mg/ml. ER-1 powinien być całkowicie rozpuszczony w roztworze ER-2.
- Aktywacja tabletu Surface
- Używając pipety P200 i sterylnej końcówki do pipety z filtrem o pojemności 200 μl, weź 200 μl mieszaniny ER-1.
- Umieścić pipetę w dolnym wlocie i przepchnąć 20 μl mieszaniny ER-1 przez dolny kanał, aż mieszanina zacznie wypływać z dolnego kanału.
- Dodać około 50 μl mieszaniny ER-1 i umieścić ją we wlocie górnego kanału. Przepchnij mieszaninę przez górny kanał, aż zacznie wypływać z wylotu górnego kanału.
- Usuń cały nadmiar mieszanki ER-1 z powierzchni chipa poprzez delikatne zasysanie. Upewnij się, że mieszanina ER-1 jest usuwana tylko z powierzchni wióra, a nie z kanałów.
- Sprawdź, czy kanały są wolne od pęcherzyków powietrza przed aktywacją ultrafioletem (UV). W przypadku wykrycia pęcherzyków powietrza należy je usunąć, przemłukując kanał mieszaniną ER-1.
- Umieść otwarte naczynie zawierające frytki w pudełku ze światłem UV (dostarczonym przez Emulate Inc.).
- Ustaw przełącznik z tyłu skrzynki oświetleniowej UV na ustawienie "Spójny". Włącz zasilanie i zainicjuj aktywację UV. Pozostaw frytki w świetle UV na 20 minut
nuta: Unikaj wystawiania personelu na działanie promieni UV.
- Usuń mieszaninę ER-1 z obu kanałów.
- Przemyć każdy kanał 200 μl roztworu ER-2.
- Usuń ER-2 z obu kanałów.
- Przemyć każdy kanał 200 μl sterylnego zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS).
- Pozostaw zimny DPBS w kanałach, aż do przejścia do następnego kroku.
- Przygotowanie i powlekanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)
- Przygotować roztwór ECM, łącząc poszczególne składniki ECM z zimnym DPBS, wodą lub innym rozpuszczalnikiem do końcowych stężeń roboczych. Roztwór ECM należy przygotowywać świeży za każdym razem, gdy jest używany.
- Pokryj zarówno górny, jak i dolny kanał chipa ECM, ze składem określonym przez typ komórki, która ma być wysiewana. Mieszaninę ECM należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Użyj lamininy (50 μg/ml) do pokrycia "strony mózgu" oraz kolagenu dożylnego i fibronektyny zmieszanych w stosunku 4:1 (320:80 μg/ml) do pokrycia "strony krwi", jak opisano w punkcie 5.6.
- Przygotowanie podwielokrotności ECM
- Rozcieńczyć 1 mg/ml lamininy w zimnym DPBS do końcowego stężenia 50 μg/ml. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Kolagen rozpuścić dożylnie w 0,1% kwasie octowym do stężenia 1 mg/ml. Roztwór inkubować w temperaturze 2–8 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 1-3 godziny lub do całkowitego rozpuszczenia.
- Przygotuj 1 ml mieszaniny kolagenu IV:fibronektyna (320 μL kolagenu IV, 80 μL fibronektyny, 600 μL sterylnego podwójnie destylowanego H2O). Mieszanina może być przechowywana w temperaturze -20 °C.
- Powlekanie wiórów za pomocą ECM
- Całkowicie zassać zimny DPBS z obu kanałów. Ustaw pipetę P200 tak, aby pobrała 100 μl roztworu kolagenu IV:fibronektyna.
- Wprowadź roztwór przez dolny wlot kanału, aż na wylocie utworzy się mała kropla. Pozostaw małą kropelkę na wlocie po wyjęciu końcówki pipety.
- Wprowadź roztwór lamininy przez wlot górnego kanału, aż na wylocie utworzy się mała kropla. Pozostaw małą kropelkę na wlocie po wyjęciu końcówki pipety.
- Przyjrzyj się uważnie kanałom, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków. Jeśli obecne są pęcherzyki, przemyj kanał odpowiednim roztworem ECM, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte.
- Powtórz kroki 5.5.1–5.5.4 dla każdego chipa.
- Dodać 1,5 ml DPBS do nakrętki stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść nakrętkę DPBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 150 mm z frytkami, aby zapewnić dodatkową wilgotność i uszczelnij naczynie parafilmem. Aby uzyskać najlepsze wyniki, inkubować frytki w temperaturze 4 °C przez noc.
nuta: W razie potrzeby komórki można wysiewać tego samego dnia, co aktywacja chipa i powlekanie ECM, chociaż preferowana jest inkubacja przez noc. Chipsy mogą być gotowe do wysiewu po 4 godzinach od dodania ECM i inkubacji chipsów w temperaturze 37 °C.
6. Zasiewanie kanału "po stronie mózgu" i różnicowanie sfer EZ w mieszane kultury neuronowe
- Przynieś naczynie zawierające przygotowane frytki do BSC. Delikatnie umyj oba kanały 200 μl NDM.
- Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odessuj nadmiar kropelek nośnika z powierzchni chipa. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek przed wysiewem każdego wióra, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek
- Umieszczanie iNPC w górnym kanale, aby wygenerować "stronę mózgu"
- Zasiej komórki (1 x 106 komórek/ml) w górnym kanale chipa. Dodaj końcówkę P200 zawierającą 30–100 μl zawiesiny komórek do wlotu górnego kanału i delikatnie zdejmij końcówkę z pipety. Weź pustą pipetę P200, wciśnij tłok, włóż go do wylotu górnego kanału i ostrożnie przeciągnij zawiesinę jednokomórkową przez chip.
- Przykryj naczynie i przenieś do mikroskopu, aby sprawdzić gęstość wysiewu i jednorodny rozkład komórek w górnym kanale. Delikatnie wyjmij końcówkę pipety z otworów wlotowych i wylotowych wiórów.
- Gęstość siewu powinna wynosić 20% pokrycia. Jeśli gęstość wysiewu jest wyższa lub niższa od oczekiwanej lub nierówna, należy zwrócić wióry do BSC, przemyć kanał 2x 200 μl świeżej pożywki i powtórzyć krok 6.3.1.
- Po potwierdzeniu prawidłowej gęstości komórek, po wysianiu każdej partii zrębków, należy natychmiast umieścić wióry w inkubatorze na 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zmyj komórki, które nie przyczepiają się świeżym NDM.
- Utrzymuj komórki w warunkach statycznych w temperaturze 37 °C z codzienną wymianą NDM przez co najmniej 48 godzin przed zainicjowaniem przepływu. iBMEC mogą być wysiewane po dołączeniu iNPC lub następnego dnia po wysianiu iNPC.
7. Umieszczanie iBMEC w dolnym kanale w celu wygenerowania "strony krwi"
- Przynieś naczynie zawierające przygotowane frytki do BSC. Delikatnie umyj dolny kanał 200 μl pożywki EC.
- Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odsysaj kropelki nadmiaru medium EC z powierzchni chipa, upewniając się, że medium pozostało w obu kanałach. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek przed wysiewem każdego wióra, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek.
- Za pomocą pipety P200 pobrać 30–100 μl zawiesiny komórek iBMEC (14–20 x 106 komórek/ml) i umieścić końcówkę we wlocie dolnego kanału. Delikatnie odłącz końcówkę od pipety, pozostawiając końcówkę zawierającą komórkę w porcie wlotowym.
- Wciśnij tłok pipety P200 z pustą końcówką, włóż do wylotu dolnego kanału i ostrożnie przeciągnij zawiesinę jednokomórkową przez dolny kanał, powoli zwalniając tłok pipety.
- Odessać nadmiar zawiesiny komórek z powierzchni chipa. Unikaj bezpośredniego kontaktu z portami wlotowymi i wylotowymi, aby upewnić się, że żadna zawiesina komórek nie jest zasysana z kanałów.
- Przykryj wiór i przenieś go do mikroskopu, aby obserwować gęstość wysiewu. Dolny kanał powinien być wypełniony bez widocznych przerw między komórkami, gdy jest obserwowany pod mikroskopem 4x lub 10x (ryc. 3).
- Jeśli gęstość siewu jest mniejsza niż 90% pokrycia lub jest nierównomiernie rozłożona, odpowiednio dostosuj gęstość komórek i powtarzaj kroki 7.2–7.6, aż do uzyskania prawidłowej gęstości w kanale. Po potwierdzeniu prawidłowej gęstości komórek (rysunek 3), wysiewaj komórki w pozostałych wiórach. Aby przymocować komórki do porowatej membrany, która znajduje się na górze dolnego kanału, odwróć każdy chip i spoczywaj w kołysce na wióry.
- Umieść mały zbiornik (stożkowa nasadka probówki o pojemności 15 ml zawierająca sterylny DPBS) wewnątrz naczynia o średnicy 150 mm, aby zapewnić wilgotność komórkom. Inkubować wióry w temperaturze 37 °C przez około 3 godziny lub do momentu, gdy komórki w dolnym kanale się złączą. Po przymocowaniu iBMEC (~ 3 godziny po wysiewie, odwróć wióry z powrotem do pozycji pionowej, aby umożliwić przyczepienie komórek do dolnej części dolnego kanału.
8. Inicjacja przepływu
- Przepływ jest zwykle inicjowany 48 godzin po wysiewie iBMEC. Ten czas jest wymagany, aby iBMEC mocno przymocowały się do chipa.
- Aby utrzymać przepływ laminarny przez chip, ważne jest odgazowanie i zrównoważenie temperatury medium. Podłoże musi być wstępnie podgrzane w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Do 50 ml podgrzanego podłoża można odgazować przez inkubację w systemie filtracji napędzanej próżnią przez 15 minut.
- Gruntowanie modułów przenośnych
- Zdezynfekuj zewnętrzną część opakowania i tacek modułu przenośnego 70% etanolem, wytrzyj i przenieś do BSC. Otwórz opakowanie i umieść moduły w tacy. Ustaw je tak, aby zbiorniki były skierowane z tyłu tacy.
- Odpipetować 3 ml wstępnie zbalansowanej, ciepłej pożywki do każdego zbiornika wlotowego. Dodaj pożywkę hodowlaną EC do zbiornika wlotowego dolnego kanału i NDM do zbiornika wlotowego górnego kanału górnego (rysunek 4).
- Odpipetować 300 μl wstępnie zbalansowanej, ciepłej pożywki do każdego zbiornika wylotowego, bezpośrednio nad każdym portem wylotowym (Rysunek 4).
- Na każdej tacy można umieścić do sześciu modułów przenośnych. Przynieś tacki do inkubatora i wsuń je całkowicie do modułu hodowlanego z uchwytem tacki skierowanym na zewnątrz.
- Wybierz i uruchom cykl "Prime" w module hodowli. Zamknij drzwiczki inkubatora i pozwól, aby moduł hodowlany zalał moduły przenośne (zajmuje to ~1 min). Cykl zalewania jest zakończony, gdy na pasku stanu pojawi się komunikat "Gotowy". Wyjmij tackę z modułu hodowlanego i przynieś ją do BSC.
- Sprawdź, czy moduły przenośne zostały pomyślnie zalane, sprawdzając spód każdego modułu przenośnego w BSC. Poszukaj obecności małych kropelek we wszystkich czterech portach.
- Jeśli którykolwiek z modułów przenośnych nie pokazuje kropel, uruchom ponownie cykl główny na tych modułach. Jeśli jakikolwiek nośnik kapie na tacę (może się to zdarzyć częściej przez porty wylotowe), wyczyść tacę 70% etanolem.
- Podłączenie chipów do modułów przenośnych, regulacja i inicjacja przepływu
- Delikatnie umyj oba kanały każdego chipa ciepłym, zrównoważonym podłożem hodowlanym specyficznym dla komórek, aby usunąć wszelkie możliwe pęcherzyki w kanale i umieść małe kropelki pożywki (zgodnie z pożywką w kanale) na górze każdego portu wlotowego i wylotowego.
- Włóż chipsy z nośnikami do modułów przenośnych i umieść do sześciu na każdej tacy. Włóż tace do modułu hodowli. Zaprogramuj odpowiednie warunki hodowli chipów narządowych (szybkość przepływu i rozciągliwość) na module hodowli.
- Zaprogramowane warunki rozpoczną się, gdy tylko cykl "Reguluj" zostanie zakończony.
nuta: Natężenie przepływu dla każdego kanału może być kontrolowane niezależnie i można je ustawić w zakresie od 0 do 1 000 μl/h. Chip BBB jest zwykle hodowany w temperaturze 30 μl/h. W przypadku przepływu mediów, takich jak media EC lub ESM z prędkością 30 μL/h i 1000 μL/h, siły tnące wynoszą odpowiednio 0,01 dyn/cm2 i 0,33 dyn/cm2.
- Uruchom cykl "Reguluj", który trwa około 2 godzin, po czym moduł hodowli zacznie płynąć w zadanych warunkach hodowli chipów narządowych.
