Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie plastra mózgu
- Użyj samców myszy C57BL/6J w wieku 4-8 tygodni. Trzymanie zwierząt w klimatyzowanym pomieszczeniu (21-23 °C; 50% wilgotności; 12 godzin/12 godzin cyklu światła/ciemności, światło włącza się o 8:00) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody.
- Pobrać 250 ml porcji sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) i umieścić ją w zlewce zawierającej lód. Jednocześnie dostarczaj ciągły gaz, który składa się w 95% zO2 i 5% CO2 .
- chirurgia
- Znieczulić zwierzę 4% izofluranem w szklanym pudełku przez około 3 minuty. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną głębokość znieczulenia (na co wskazuje brak reakcji na uszczypnięcie palca), umieść je na płytkiej tacy wypełnionej pokruszonym lodem i usuń głowę za pomocą nożyczek.
- Odsłoń czaszkę i odetnij pozostały mięsień. Następnie, za pomocą rongeurs, oderwij grzbietową powierzchnię czaszki od mózgu. Odetnij boki czaszki za pomocą rongeurs. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 75% roztworem etanolu.
- Za pomocą szpatułki przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu i usuń mózg. Po dekapitacji szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowato natlenionym aCSF.
- Przygotowanie jelita przyśrodkowego wzgórza (MT)-przedniej kory obręczy (ACC) Brain Slice
nuta: Przygotuj wycinki, które zawierają ścieżkę od MT do ACC.
- Ręcznie wytnij blok mózgu za pomocą dwóch strzałkowych nacięć 2,0 mm bocznych do linii środkowej w każdej półkuli, aby wyświetlić anatomię podkorową. Następnie wykonaj dwa cięcia pod kątem. Wykonaj pierwsze cięcie poprzeczne równolegle do widocznego przewodu światłowodowego w prążkowiu.
- Wykonaj drugi przekrój poprzeczny od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego między spoidłem przednim a drogami wzrokowymi, które są brzuszne i równoległe do szlaku wzgórzowo-obręczowego.
- Przymocuj blok mózgu do kątowej płytki (~120°) za pomocą kleju cyjanoakrylowego i wykonaj nacięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Rozłóż płytkę, spłaszcz ją i przyklej do stopnia komorowego wibratomu.
- Zrób przyśrodkowe plastry mózgu wzgórza-ACC (o grubości 500 μm), a następnie zanurz je w lodowato natlenionym aCSF. Przenieść plastry do komory rejestracyjnej i utrzymywać w temperaturze 32 °C pod ciągłą perfuzją (12 ml/min) z natlenionym aCSF przez 1 godzinę.
