$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Mikrorozwarstwienie grzbietowo-bocznego kresomózgowia
- Przygotuj pożywkę separacyjną (100 ml): 98,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 0,5 ml 5 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) pH 7,4, 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml).
- Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę preparacyjną.
- Usunąć zarodki zarodkowe w 14. dniu (E14) ciężarnej myszy C57/Bl6 (Mus musculus) w znieczuleniu izofluranem.
nuta: Rozważ E0 jako dzień wykrycia czopa dopochwowego. Rozbior należy zakończyć nie później niż 1 godzinę po usunięciu z ciężarnej myszy. Protokół ten ma również zastosowanie do zarodków E11-E17.
- Usunąć zarodki przez histerektomię w sterylnych warunkach.
- Przenieść zarodki na szalkę Petriego z zimnym podłożem preparacyjnym (4 °C).
- Usuń mózg z czaszki, przecinając wzdłuż podłużnej szczeliny. Liczba zarodków zwykle waha się od pięciu do dziesięciu. Każdy mózg E14 wytwarza około 2 x 106 komórek, w tym neurony progenitorowe i postmitotyczne (stosunek 1:1)
nuta: Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby wykonać następujące czynności.
- Usuń opony mózgowe za pomocą kleszczy preparacyjnych. Podziel kresomózgowie pośrodku, aby oddzielić półkule. Aby wyizolować grzbietowo-boczną kresomózgowie, przeciąć wzdłuż krzywej grzbietowo-przyśrodkowej i granicy palijalno-podpalialnej za pomocą kleszczy preparacyjnych. Przenieść grzbietowo-boczną kresomózgowie, do probówki o pojemności 2 ml z zimnym podłożem preparacyjnym (4 °C), aż wszystkie mózgi zostaną wypreparowane.
2. Dysocjacja komórek i powlekanie
- Przygotuj pożywkę proliferacyjną (50 ml DMEM + 10% FCS): 44 ml Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), 5 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,5 ml 40% glukozy, 0,5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml). Filtruj i sterylizuj pożywkę proliferacyjną.
- Przygotuj pożywkę różnicującą (50 ml DMEM + 2% B27): 48 ml DMEM, 1 ml B27, 0,5 ml 40% glukozy, 0,5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml). Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę różnicującą.
- Po mikropreparacji grzbietowo-bocznej kresomózgowia od myszy E14, odwirować probówkę z pobraną tkanką i zimnym podłożem preparacyjnym (przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 340 x g) w celu wytrącenia tkanki.
- Usunąć sklarowany osad pipetą i dodać 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,05%) w celu roztrawienia chemicznego. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 2 ml pożywki proliferacyjnej, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
- Wypoleruj końcówkę szklanej pipety Pasteura nad palnikiem gazowym lub palnikiem Bunsena przez kilka sekund, aby nieznacznie zwęzić otwór. Umyj pipetę, zasysając FCS, aby pokryć końcówkę. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, należy mechanicznie rozdzielić komórki za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura pokrytej FCS.
- Odwirować komórki (przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 340 x g). Usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodać 1 ml pożywki do proliferacji i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety. Powtórz ten krok raz.
- Przygotować zawiesinę komórek w stosunku 1:1 przy użyciu 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Niezdolne do życia komórki będą niebieskie. Korzystając z komory Neubauera, policz liczbę żywotnych komórek (niebarwionych).
- Rozcieńczyć komórki w pożywce proliferacyjnej, aby uzyskać 106 komórek/ml. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (około 2,5 × 105 komórek/cm2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
nuta: Nie używaj szkiełek nakrywkowych, ponieważ mogą się one przesuwać podczas eksperymentu i zmieniać pole obserwacji. Alternatywnie należy użyć płytek do hodowli tkankowych ze szklanym dnem.
nuta: Jeśli nie używasz naczyń wielonastawnych poddanych hodowlom komórkowym, ważne jest, aby wstępnie traktować płytki poli-D-lizyną (50 μg/ml) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Płytki poddane działaniu PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C po umyciu wodą destylowaną.