$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
UWAGA: Roztwory do hodowli komórkowych powinny być przygotowywane przy użyciu sterylnych procedur w komorze bezpieczeństwa biologicznego i filtrowane przy użyciu 0,2 μm, aby zapobiec skażeniu.
1. Przygotowanie roztworów i pożywki hodowlanej
- Przygotować roztwór powlekający lamininę, rozcieńczając 20 μl wywaru z lamininy o stężeniu 1 mg/ml w 2 ml sterylnegodestylowanego H2O. Przygotować w dniu rozbioru
- Przygotuj 10% roztwór zatrzymujący surowicę końską (końską) (ES), dodając 5 ml ES do 45 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS). Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 4% roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA), dodając 2 g proszku BSA do 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i doprowadzając do końcowej objętości 45 ml. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować roztwór podstawowy papainy, rozcieńczając papainę do 3 mg/ml w 1x HBSS. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować roztwór dezoksyrybonukleazy (DNazy), dodając 20 mg proszku DNazy do sterylnegoH2Oi doprowadzając go do końcowej objętości 20 ml. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować roztwór podstawowy kwasu askorbinowego, dodając 352 mg kwasu askorbinowego do sterylnego destylowanego H2O i doprowadzając go do końcowej objętości 20 ml. W razie potrzeby podgrzać w łaźni o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Sterylny filtr za pomocą systemu filtrów 0,2 μm lub końcówki filtra strzykawkowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, dodając do 50 ml pożywki Neurobasel: 500 μl Glutamax (100x), 500 μl surowicy końskiej, 1 ml B-27, 100 μl kwasu askorbinowego, 500 μl penicyliny-streptomycyny, 50 μl kanamycyny i 50 μl ampicyliny. Sterylny filtr wykorzystujący system filtrów 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj 0,01% roztwór Triton X-100, dodając 1 ml Triton X-100 do 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 10% roztwór. Ponieważ Triton X-100 jest lepki, pipetuj powoli, aby końcówka całkowicie się napełniła. Podgrzać w łaźni o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia, jeśli to konieczne. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Aby rozcieńczyć 10% bulion Triton X-100 do 0,01%, wykonaj 3 seryjne rozcieńczenia 1:10. Rozcieńczyć 1 ml 10% bulionu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 1% roztwór. Rozcieńczyć 1 ml 1% roztworu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 0,1% roztwór. Rozcieńczyć 1 ml 0,1% roztworu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 0,01% roztwór.
- Przygotuj 10% i 1% roztwory normalnej surowicy koziej (NGS), dodając 1 ml NGS do 9 ml 1x PBS dla 10% roztworu i 100 μL NGS do 9,9 ml 1x PBS, aby uzyskać 1% roztwór.
- Przygotować roztwór podstawowy glutaminianu (100 mM), dodając 735 mg kwasu L(+)-glutaminowego do sterylnego destylowanego H2O i doprowadzając go do końcowej objętości 50 ml. Rozpuszczalność w tym stężeniu będzie problemem. Dodanie małych objętości (100 μl) 1 M kwasu solnego jest wystarczające do zwiększenia rozpuszczalności.
- Przygotować roztwór podstawowy NBQX (10 mM), dodając 50 mg NBQX do sterylnego destylowanegoH2Oi doprowadzając go do końcowej objętości 13 ml.
2. Przygotowanie naczyń hodowlanych i szkiełek nakrywkowych (Wykonane dzień przed sekcją)
UWAGA: Odkryliśmy, że połączenie trzech środków powlekających, poli-L-lizyny, poli-L-ornityny i lamininy, pozwala na idealną adhezję i żywotność komórek.
- Umieść 10 szalek Petriego o średnicy 35 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść dwa okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w każdym naczyniu i wypełnij 70% EtOH przez 10 minut. Użyj linii próżniowej, aby zassać pozostały EtOH z każdej płytki, umożliwiając całkowite odparowanie EtOH.
- Odpipetować ~90-100 μL 0,1% roztworu poli-L-lizyny na każde szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że całe szkiełko nakrywkowe jest zakryte. Przykryj naczynia pokrywkami i umieść je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
- Odessać pozostały roztwór poli-L-lizyny z każdego szkiełka nakrywkowego i spłukać sterylnymH2O.
- Powtórz kroki 2.2 – 2.3 z 0,1% roztworem poli-L-ornityny.
- Ponownie powtórz kroki 2.2 – 2.3 z 0,01% roztworem lamininy. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 do momentu, gdy będą gotowe do posiewu komórek następnego dnia.
3. Sekcje embrionalne myszy
UWAGA: Używamy od 4 do 6 ciężarnych myszy na kulturę. Chociaż większość procesu preparacji odbywa się poza komorą bezpieczeństwa biologicznego, nadal ważne jest, aby zachować sterylną procedurę. Idealne jest obfite stosowanie 70% EtOH na powierzchniach w pobliżu mikroskopu preparacyjnego i na narzędziach chirurgicznych. Podczas sekcji można również nosić maskę, aby jeszcze bardziej zapobiec zakażeniu. Dodatkowo w pożywce hodowlanej używamy 4 oddzielnych antybiotyków, więc zanieczyszczenie jest mało prawdopodobne. Jeśli jednak stosowanie antybiotyków jest problematyczne, ten zestaw do preparacji można przenieść do sterylnego kaptura. W celu zachowania żywotności komórek wszystkie roztwory preparacyjne powinny być wstępnie schłodzone w temperaturze 4 °C, a rozbiory powinny zostać zakończone tak szybko, jak to możliwe. Nie wykonujemy sekcji na lodzie. Metoda preparacji embrionalnych neuronów śródmózgowia myszy jest identyczna z poprzednio opisanymi metodami.
- Przygotuj miejsce na ławce w pobliżu mikroskopu preparacyjnego za pomocą podkładki chłonnej i spryskaj obficie 70% EtOH.
- Spryskać dwie szklane szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i jedną szklaną szalkę Petriego o wymiarach 50 x 10 mm 70% EtOH i pozostawić EtOH do odparowania. Po odparowaniu umieść 50 ml sterylnego 1x HBSS na każdej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.
- Zanurz nożyczki chirurgiczne, kleszcze i ostrze mikrotomu w 70% EtOH na minimum 10 minut w celu sterylizacji. Umieść instrumenty na podkładce chłonnej do wyschnięcia.
- Używając CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy, poddaj eutanazji 2-3-miesięczne myszy w ciąży w 14 dniu embrionalnym.
- Spryskaj brzuch uśpionych myszy 70% EtOH. Za pomocą kleszczy chwyć dolną część brzucha i otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek chirurgicznych. Rozpocznij cięcie w pobliżu miejsca, w którym kleszcze trzymają brzuch, wykonując boczne nacięcia z każdej strony, aż ściana brzucha będzie mogła zostać odchylona do tyłu, a macica będzie wyraźnie widoczna.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych odetnij oba końce rogu macicy. Następnie usuń macicę i umieść ją na szalce Petriego z 1x HBSS.
- Za pomocą kleszczy z prostą końcówką ostrożnie usuń zarodki z macicy. Pozostaw zarodki w HBSS przez cały ten proces. Używając kleszczy lub ostrza do mikrotomu, szybko odetnij zarodki, przecinając je w pobliżu szyi. Wykonanie jak najbardziej równego cięcia.
- Pod mikroskopem preparacyjnym przenieś główkę zarodka na suchą szalkę Petriego o średnicy 50 mm i umieść ją po stronie brzusznej. Ustabilizuj głowę za pomocą kleszczy, umieszczając i penetrując w pobliżu oczu/pyska. Kleszcze powinny być pochylone w dół pod kątem ~45°, aby uniknąć penetracji śródmózgowia.
- Z drugiej strony za pomocą kleszczy ostrożnie usuń półprzezroczystą warstwę skóry i czaszki tuż przed wystającym grzbietem śródmózgowia. Zacznij w pobliżu linii środkowej i usuwaj skórę i czaszkę doogonowo, aż śródmózgowie zostanie całkowicie odsłonięte.
- Trzymaj kleszcze prostopadle do odsłoniętego śródmózgowia, z jednym końcem między korą a śródmózgowiem, a drugim w pobliżu móżdżku. Dociśnij i ściśnij kleszcze razem, aby usunąć całe śródmózgowie. Segment śródmózgowia powinien mieć grubość około 0,5 mm. Umieść segment śródmózgowia na drugiej szalce Petriego wypełnionej świeżym 1x HBSS. Powtórz ten proces dla każdego zarodka.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustaw segment mózgu brzuszną stroną skierowaną do góry. Jeśli opony mózgowe są nadal przyczepione, ostrożnie je usuń, chwytając je kleszczami i podnosząc do góry i odsuwając od segmentu mózgu.
- Segment mózgu powinien mieć 4 widoczne ćwiartki. Umieść segment w taki sposób, aby dwie mniejsze ćwiartki znajdowały się wyżej niż dwie większe ćwiartki. Istnieje wyraźny grzbiet oddzielający dwa górne (małe) ćwiartki od dolnych dwóch (dużych) kwadrantów.
- Za pomocą kleszczy ściśnij i oddziel górne ćwiartki od dolnych kwadrantów, a następnie odrzuć górne ćwiartki. Pozostałe dolne ćwiartki będą miały nadmiar tkanki bocznie po stronie grzbietowej, tkanka ta będzie wyglądać na mniej nieprzezroczystą niż pozostała tkanka brzuszna. Usuń mniej gęstą tkankę grzbietową i wyrzuć. Pozostały segment powinien zawierać zarówno istotę czarną pars compacta (SNc), jak i brzuszny obszar nakrywki (VTA).
- Za pomocą kleszczy przetnij pozostały segment tkanki brzusznej na 4 mniejsze kawałki i za pomocą pipety o szerokim otworze 1 ml przenieś te segmenty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 1x HBSS. Utrzymuj stożkową rurkę z segmentami mózgu na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
- Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych segmentów mózgu.
4. Dysocjacja komórek
- Trawienie enzymatyczne komórek
- Ostrożnie odessać HBSS ze stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej segmenty śródmózgowia, pozostawiając segmenty na dnie probówki.
- Dodać ~800 μl roztworu papainy do probówki i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 7 minut. Ponownie zawiesić komórki, przesuwając probówkę i zastąpić inkubatorem o temperaturze 37 °C na dodatkowe 7 minut.
- Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 1 ml należy usunąć tylko segmenty śródmózgowia z podwielokrotności 1 ml DNazy. Pozwól segmentom dotrzeć do dna podwielokrotności lub około 1 minuty ekspozycji.
- Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze o pojemności 1 ml należy usunąć tylko segmenty śródmózgowia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml roztworu zatrzymującego. Pozwól, aby segmenty osiadły na dnie probówki i powtórz płukanie w dodatkowej stożkowej probówce wypełnionej roztworem zatrzymującym.
- Mechaniczne rozcieranie zawiesiny komórek
- W drugim zatrzymaniu, probówce do płukania roztworu, używając końcówki do pipety o szerokim otworze 1 ml, odpipetuj komórki w górę i w dół 10 razy, aż nie będą widoczne duże segmenty tkanki. Ważne jest, aby unikać nadmiernego miareczkowania w celu zminimalizowania lizy komórek.
- Powoli odpipetować 300 μl 4% roztworu BSA na dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej segmenty mózgu. Ostrożnie zdejmij końcówkę pipety, aby utrzymać warstwę zawiesiny. Wirować przy 0,4 x g przez 3 min. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400 μl pożywki do hodowli komórkowych.
5. Powlekanie komórek
UWAGA: Bazując na doświadczeniu, zbiera się około 100 000 żywotnych komórek na zarodek. Ciężarne myszy w wieku 2-3 miesięcy zazwyczaj mają miot o wielkości 8-10 zarodków; dlatego przybliżone oszacowanie całkowitej wydajności komórek na ciężarną mysz wynosi około 1 miliona komórek.
- Za pomocą hemocytometru wykonaj zliczanie komórek, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do 2,000 komórek/μl za pomocą pożywki do hodowli komórkowych. Krótko rozcierać, aby wymieszać.
- Usunąć z inkubatora szkiełka nakrywkowe z roztworem lamininy z etapu 2 i odessać pozostały roztwór lamininy z powlekanych szkiełek nakrywkowych za pomocą próżni. Płytkować szybko, aby zapobiec całkowitemu wyschnięciu szkiełek nakrywkowych. Odpipetować 100 μl (2,0 x 105 komórek/szkiełko nakrywkowe) na każde szkiełko nakrywkowe i umieścić szalki Petriego w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
- Ostrożnie dodać 3 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej pożywki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wykonuj zmiany połowy pożywki dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie.
6. Zakażenie hodowli komórkowej w 14 DIV wektorami wirusowymi (AAV) związanymi z adenowirusem
- Na każde danie przygotuj 1 ml pożywki DMEM bez surowicy z 1 μl hSyn-GCaMP6f AAV (miano 1,0 x10 13)
- Odessać pożywkę do hodowli komórkowej z każdej szalki i zastąpić ją 1 ml DMEM bez surowicy zawierającej hSyn-GCaMP6f. Następnie umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
- Odessać pożywkę bez surowicy zawierającą AAV i zastąpić ją 3 ml pożywki do hodowli komórkowych. Umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odkryliśmy, że 5-7 dni infekcji AAV pozwala na uzyskanie idealnego poziomu ekspresji GCaMP. Przez cały ten okres infekcji wirusowej kontynuuj zmianę pożywki co 2-3 dni.
7. Obrazowanie konfokalne Ca2+ na żywo między 19-21 DIV
- Przygotowanie zapisu
- Aby przygotować 1 l buforu rejestrującego HEPES, dodaj: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glukozy, 2,381 g HEPES, 2 ml 1 M roztworu podstawowego CaCl2 i 500 μl 1 M roztworu podstawowego MgCl2 do 800 ml sterylnegodestylowanego H 2O. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l.
- Aby uzyskać 200 ml 20 μM buforu rejestrującego glutaminianu, rozcieńczyć 40 μl 100 mM roztworu podstawowego glutaminianu w 200 ml buforu rejestrującego HEPES opisanego powyżej.
- Aby uzyskać 200 ml 10 μM buforu rejestrującego NBQX, rozcieńczyć 200 μl 10 mM roztworu podstawowego NBQX w 200 ml buforu rejestrującego HEPES.
- Obrazowanie konfokalne
- Napełnić sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 mm 3 ml buforu rejestrującego.
- Wyjąć z inkubatora w temperaturze 37 °C szalkę Petriego o średnicy 35 mm z zakażonymi kulturami. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie chwyć krawędź jednego szkiełka nakrywkowego i szybko przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną buforem nagrywającym. Umieścić pozostałe szkiełko nakrywkowe w pożywce z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Przetransportować szalkę z buforem rejestrującym do mikroskopu konfokalnego.
- Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Przejdź do następnego kroku podczas inicjalizacji.
- Uruchom pompę perystaltyczną i umieść linię w buforze nagrywającym. Skalibruj prędkość przepływu na 2 ml/min.
- Przenieść zakażone szkiełko nakrywkowe z płytki Petriego o średnicy 35 mm do kąpieli rejestrującej.
- Korzystając z 10-krotnego zanurzenia w wodzie i światła BF, znajdź płaszczyznę ostrości i poszukaj obszaru o dużej gęstości ciał komórek neuronowych. Przełącz się na obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie i za pomocą światła BF ponownie ustaw ostrość próbki.
- W oknie "Lista barwników" w FluoView wybierz AlexaFluor 488 i zastosuj go.
- Ekspresja AAV może być zmienna, dlatego, aby zapobiec nadmiernej ekspozycji i fotowybielaniu fluoroforów, zacznij od niskich ustawień HV i mocy lasera. Dla kanału AlexaFluor 488 ustaw wysokie napięcie (HV) na 500, wzmocnienie na 1x, a przesunięcie na 0. W przypadku linii laserowej 488 ustaw moc na 5%. Aby zwiększyć efektywną objętość obrazowaną w płaszczyźnie z, należy zwiększyć rozmiar otworka do 300 μm. Użyj opcji skanowania "focus x2", aby optymalnie dostosować sygnały emisji do poziomów niepełnego nasycenia. Z tego miejsca ustawienia można dostosowywać, aż do uzyskania idealnej widoczności każdego kanału.
nuta: Aby dokładnie uchwycić pełny zakres strumieni Ca2+ za pomocą GCaMP, dostosuj podstawowe ustawienia HV i mocy lasera, aby umożliwić wzrost intensywności fluorescencji bez nadmiernego nasycenia detektora.
- Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu przesuń stolik, aby zlokalizować obszar z wieloma komórkami wykazującymi spontaniczne zmiany fluorescencji GCaMP6f i skupić się na żądanej płaszczyźnie obrazowania.
- Użyj narzędzia "Przytnij prosto", aby przyciąć ramkę obrazowania do rozmiaru, który pozwala osiągnąć odstęp między klatkami wynoszący nieco poniżej 1 sekundy. Jest to konieczne, aby ustawić interwał obrazowania na 1 klatkę na sekundę.
- Ustaw okno "Interwał" na wartość 1,0, a okno "Liczba" na 600.
nuta: Aby dostarczyć różne rejestrujące w żądanym punkcie czasowym (300 s), ważne jest, aby skalibrować opóźnienie pompy w celu dostarczenia nowego roztworu do kąpieli. Będzie to zależało od szybkości perfuzji roztworu (2 ml/min) i długości przewodu używanego do pompowania roztworu.
- Aby nagrać film z serii t, wybierz opcję "Czas", a następnie użyj opcji skanowania "XYt", aby rozpocząć obrazowanie.
- Obserwuj pasek postępu obrazowania i przesuń linię z bufora zapisu HEPES do bufora zapisu glutaminianu 20 μM w odpowiednim punkcie czasowym (np. jeśli opóźnienie pompy jest skalibrowane do dostarczania roztworu po 60 s, przesuń linię do bufora glutaminianu po 240 klatkach, aby dostarczyć glutaminian po 300 s).
- Po zakończeniu obrazowania wybierz przycisk Seria zakończona i zapisz gotowy film z serii t. Kontynuuj perfuzję 20 μM glutaminianu przez dodatkowe 5 minut, tak aby hodowane neurony były wystawione na działanie glutaminianu przez łącznie 10 minut. Powtórz ten proces dla każdego szkiełka nakrywkowego, które ma być zobrazowane.
- Po dodatkowych 5 minutach ekspozycji na glutaminian 20 μM należy wyjąć szkiełko nakrywkowe z kąpieli i umieścić je z powrotem na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej bufor rejestrujący do dnia zakończenia obrazowania.