Przygotowanie plasterków kory nosa i hipokampa z mózgu szczeniaka szczura

Streszczenie

Źródło: Valente, C. A., et al., Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa. J. Vis. Exp. (2021)

Wideo demonstruje metodę uzyskiwania wycinków kory nosowej i hipokampa z mózgu szczeniaka szczura i hodowania ich w błoniastych wkładkach na wielodołkowej płytce wypełnionej pożywką do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie plastrów kory nosowej i hipokampa

UWAGA: Do przygotowania wycinków kory nosowej i hipokampa używa się szczurów P6-7 Sprague-Dawley.

1. Konfiguracja kultury i przygotowanie podłoża
   1. W dniu poprzedzającym hodowlę należy przygotować wymagane podłoża i umieścić je w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotuj pożywkę preparacyjną: 25 mM glukozy w zrównoważonym roztworze soli Geya (GBSS).
   3. Przygotuj pożywkę: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% surowica końska (HS), 25 mM glukozy, 30 μg/ml Gentamycyny.
   4. Przygotuj pożywkę podtrzymującą: Neurobaseal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutaminy, 30 μg/ml Gentamycyny, HS (15%, 10%, 5% i 0%).
2. Pobieranie mózgów
   1. Tuż przed rozpoczęciem hodowli dodać 1,1 ml pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej za pomocą pipety P1000 i umieścić ją w temperaturze 37 °C.
   2. Umieść cały sprzęt (mikroskop preparacyjny, rozdrabniacz tkanek, lampę sekcyjną, narzędzia preparacyjne, elektrody, płytki, wkładki i bibuły filtracyjne) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
   3. Dostosuj grubość plastra do 350 μm.
   4. Wyjmij GBSS z lodówki. Dodaj 5 ml GBSS do sześciu szalek Petriego. Na jedno zwierzę przypada sześć szalek Petriego.
   5. Poddaj eutanazji szczeniaka szczura. Wykonaj dekapitację za pomocą ostrych nożyczek u podstawy pnia mózgu zwierzęcia.
   6. Umyj głowę zwierzęcia trzy razy w zimnym GBSS i zabierz ją do szafki bezpieczeństwa.
3. Izolacja tkanek i przygotowanie plastrów
   1. Mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby przytrzymać głowę.
   2. Cienkimi nożyczkami przetnij skórę/skórę głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu kręgowego w kierunku płatów czołowych i odłóż na bok.
   3. Przeciąć w taki sam sposób jak czaszkę i wzdłuż szczeliny poprzecznej mózgu (przestrzeń między mózgiem a móżdżkiem). Za pomocą zakrzywionych długich kleszczy rozsuń go.
   4. Wyrzuć opuszki węchowe szpatułką. Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry (ryc. 1A).
   5. Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i idź wzdłuż linii środkowej, a szpatułka bardzo ostrożnie otwiera każdą półkulę (ryc. 1B).
   6. Za pomocą kleszczyków o krótkiej krzywiźnie ostrożnie usuń nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp, nie dotykając struktury hipokampa. Następnie za pomocą szpatułki przeciąć poniżej każdego hipokampa (ryc. 1C).
   7. Podnieś jedną półkulę i umieść ją hipokampem skierowanym do góry na bibule filtracyjnej. Powtórz procedurę z drugą półkulą i umieść ją równolegle do pierwszej, w bibule filtracyjnej. Umieść bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu tkanek, tak aby półkule były prostopadłe do ostrza, i pokrój półkule na plasterki o wielkości 350 μm (ryc. 1D).
   8. Umieść pokrojoną tkankę na szalce Petriego z zimnym GBSS (ryc. 1E).
   9. Ostrożnie oddziel plastry za pomocą elektrod z okrągłą końcówką (Rysunek 1F). Zachowaj tylko plastry z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak kora śródwęchowa i okołęchowa (ryc. 1G).
   10. Umieść każdy plasterek na wkładce (Rysunek 1H-I) za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką. Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół każdej plastry za pomocą pipety P20 (Rysunek 1J). Cztery wycinki kory nosowej i hipokampa można hodować w jednej wkładce (ryc. 1K).
4. Utrzymanie kultury
   1. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
   2. Rozgrzać podłoże w temperaturze 37 °C.
   3. Wyjmij płytki z inkubatora. Podnieś każdą wkładkę, przytrzymując plastikową krawędź kleszczami (Rysunek 1L).
   4. Użyj wolnej ręki, aby zassać podłoże ze studni. Umieścić wkładkę z powrotem w studzience i dodać 1 ml za pomocą pipety P1000 świeżo podgrzanego podłoża (ryc. 1M). Powtórz tę czynność dla wszystkich wkładek. Upewnij się, że między membraną a medium nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.

Wyniki

Rycina 1: Szczegółowa procedura przygotowania wycinków organotypowych z kory nosa i hipokampa. (A) Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry. (B) Włóż kleszcze do móżdżku. Otwórz mózg przez linię środkową i usuń nadmiar tkanki nad hipokampem. (C) Za pomocą szpatułki naciętej poniżej hipokampa, jak ws...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ostrza do rękojeści skalpela	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10011-00
System komór do wycinania mózgu/tkanek	Instrumenty Warnera
Wkładki do hodowli komórkowych, 30 mm, hydrofilowy PTFE	Millipore SAS	PICM03050
Konwencjonalny inkubator	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Linia funkcyjna	Ustawione na 37 °C i 5% CO2
D(+)-Glukoza jednowodna	Merck Millipore	1.08342.1000
D-(+)-Roztwór glukozy, 45% w wodzie	Sigma	G8769
wodorofosforan sodu dwuwodny	Merck Milipore	1.06580.1000
Dumont #5 Kleszcze drobne Biologie Inox	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11254-20
Kleszcze Dumont #5 Standard Inox	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11251-20
Dumont #7 Kleszcze Standard Dumoxel	Narzędzia naukowe	Rozdział 11271-30
Dumont Medical #7S Kleszcze Short Curve Inox	Narzędzia naukowe	Rozdział 11273-22
Roztwór podstawowy gentamycyny, 50 mg/ml	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15750-037
Zrównoważony roztwór soli Geya (GBSS)	Przemysł biologiczny	01-919-1A
Elektrody szklane	Produkty naukowe	Zobacz materiał GB150F-10	Okrągłe końcówki domowej roboty
Szklane pipety Pasteura, 230 mm	VWR Polska	612-1702
Surowica dla koni, inaktywowana termicznie (HS)	Thermo Fisher Naukowy	26050-088
Szpatułka tęczówki zakrzywiona	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10092-12
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Labculture klasy II	HERASafe	Zobacz materiał HS 12
L-glutamina, roztwór 200 mM (Q)	Thermo Fisher Naukowy	25030-024
Neurobaseal-A Medium (NBA)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 10888-022
Opti-MEM® I Pożywka o obniżonej surowicy	Thermo Fisher Naukowy	31985-047
Platyna 5 ostrzy	Gillette
Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 55 mm	Whatman	Numer katalogowy: 1001-055	Średnia retencja 11μm
Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 90 mm	Whatman	Numer katalogowy: 1001-090	Średnia retencja 11μm
Rękojeść skalpela	Narzędzia naukowe	Zobacz materiał 91003-12
Sterylne płytki 6-dołkowe z powłoką TC	Corning	CORN3516
Regulator temperatury	SYSTEMY MEDYCZNE CORP.	TC-102
Rozdrabniacz tkanek	Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Ustawione na 350 μm

powiedział: TGL powiedział: