Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja, hodowla i stymulacja komórek NK
- Wygeneruj nienaruszony neuron nocyceptora (kontrola rodzeństwa z miotu; TRPV1wt::D TAfl/wt) i myszy poddane ablacji (TRPV1cre::D TAfl/wt) przez skrzyżowanie myszy z toksyną lox-stop-lox-błoniczą (DTAfl/fl) z myszami TRPV1cre/wt.
- Stosując wdychanie CO2, poddaj eutanazji naiwną mysz kontrolną z miotu (TRPV1wt::D TAfl/wt).
- Zebrać śledzionę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Homogenizuj śledzionę za pomocą tłuczka.
- Rozcieńczyć komórki 1 ml sterylnego PBS.
- Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 50 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Uzupełnić objętość (10 ml) sterylnym PBS.
- Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.
- Zawiesić komórki w stężeniu 10-8 komórek/ml w uzupełnionym pożywce RPMI 1640.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby magnetycznie oczyścić komórki NK (Natural Killer) śledziony za pomocą mysiego zestawu do izolacji komórek NK. Potwierdź czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej.
- Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki NK w uzupełnionej pożywce hodowlanej RPMI 1640 (zawierającej IL-2 i IL-15).
- Hodowla 2 × 106 komórek NK/ml w 96-dołkowej płytce dolnej U przez 48 godzin.
2. Izolacja i hodowla neuronów DRG
- Na 24 godziny przed zakończeniem stymulacji komórek NK (krok 1.15) pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl/basenik lamininy (1 ng/ml) i inkubować przez 45 minut (37 °C).
- Po inkubacji usunąć roztwór i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Stosując wdychanie CO2, poddaj eutanazji neuron nocyceptora w stanie nienaruszonym (kontrola rodzeństwa z miotu; TRPV1wt::D TAfl/wt) lub myszy z ablacją (TRPV1cre::D TAfl/wt).
UWAGA: Wdychanie CO2 jest preferowane w przypadku zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ pozwala uniknąć zakłócenia nerwów rdzeniowych połączonych z DRG (zwojem korzenia grzbietowego).
- Przymocuj mysz do tablicy w pozycji leżącej, unieś skórę i nacinaj skórę wzdłuż kolumny grzbietowej.
- Odetnij staw lędźwiowo-krzyżowy i oddziel kość krzyżową od odcinka lędźwiowego kręgosłupa nożyczkami.
- Oddziel kręgosłup, przecinając mięśnie i żebra po obu stronach kręgosłupa w kierunku czaszki, aż do osiągnięcia podstawy czaszki.
- Za pomocą nożyczek odetnij kręgosłup w stawie szczytowo-potylicznym.
- Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z kręgosłupa.
- Przypnij i otwórz kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy i uzyskać dostęp do DRG. Poszukaj DRG w otworze międzykręgowym połączonym z rdzeniem kręgowym przez korzeń grzbietowy, ale oddzielonym od opon mózgowych.
- Zbierz DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml lodowato uzupełnionego DMEM.
- Odwirować preparat (200 × g, 5 min, temperatura pokojowa) i usunąć sklarowany nad osadem.
- Dodać 250 μl PBS zawierającego kolagenazę IV (1 mg/ml) i dypazę II (2,4 j./ml).
- Inkubować DRG z roztworem kolagenazy IV/Dispazy II (C/D) (80 min, 37 °C, łagodne mieszanie). Podczas łączenia zwojów od kilku myszy utrzymuj stosunek 125 μl roztworu C/D na ganglion
.
- Aby dezaktywować enzymy, dodaj 5 ml uzupełnionej pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
- Odwirować roztwór (200 × g, 5 min) i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
- Aby uniknąć niepożądanej utraty komórek, pozostaw ~100 μl supernatantu.
- Dodać 1 ml uzupełnionej pożywki DMEM.
- Za pomocą pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się rozmiarach, delikatnie rozetrzyj DRG (~10 góra/dół na rozmiar pipety Pasteura) na preparat jednokomórkowy.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w sterylnym PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) do końcowego stężenia 15%. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
- Stwórz gradient BSA w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, dodając 2 ml sterylnego PBS i powoli dozując 1 ml 15% roztworu BSA na dno probówki. Unikaj zakłócania gradientu, delikatnie wyjmując pipetę.
- Za pomocą pipety P200 powoli pipetować zawiesinę zwojów nerwowych (która zawiera neurony) na bok rurki do gradientu.
- Odwirować gradient BSA zawierający neurony (200 × g, 12 min, temperatura pokojowa). Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki na prędkość minimalną.
UWAGA: Po odwirowaniu neurony znajdą się na dnie probówki, podczas gdy szczątki komórek zostaną uwięzione w gradiencie BSA.
- Delikatnie usunąć cały supernatant za pomocą pipety.
- Ponownie zawiesić komórki w 500 μl Neurobasal.
- Płytka 104 neurony na dołek (200 μl neurobazal/studzienka) na pokrytej lamininą, płaskiej 96-dołkowej płytce.
UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~8 studni na mysz.
- Hodowla neuronów (37 °C, przez noc), aby umożliwić przyczepienie się.
3. Współkultura
- Powoli usuń neuronalę z hodowli neuronów.
- Po 48 godzinnej stymulacji IL-2 i IL-15 (patrz kroki 1.14-1.15), ponownie zawieś komórki NK i dodaj 105 komórek NK / studzienkę do hodowli neuronów (96-dołkowa płaska płytka denna).
UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~6 studzienek na mysz.
- Współhodowla komórek w uzupełnionym neurobazalnym MX (37 °C, 48 h).
