Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie

1. Przygotuj pożywkę dla neuronów dopaminowych (DPM) z 0,46% D-glukozy, 1% L-glutaminy, 1% N2, 0,2% prymocyny, uzupełnioną zmodyfikowaną mieszanką Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12). Przefiltruj DPM po wymieszaniu składników. Przechowywać DPM w temperaturze 4 °C i ogrzać każdą porcję tylko raz.
   nuta: DPM nie powinien zawierać czynnika wzrostu pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF), ponieważ zmniejszy to akumulację α-synukleiny w neuronach dopaminowych.
2. Przygotuj pipety ze szkła silikonowanego, które są wyjątkowo hydrofobowe, minimalizując w ten sposób przyleganie do powierzchni i utratę komórek podczas początkowego obchodzenia się z neuronami embrionalnymi.
   1. Dodać 10 ml płynu silikonowego do 1 litra wody destylowanej i wymieszać, mieszając w naczyniu o pojemności 2 litrów. Szklane pipety należy pozostawić zanurzone w roztworze silikonowym na 15 minut.
   2. Przepłucz pipety 3–5 razy wodą destylowaną. Suszyć pipety przez noc w temperaturze pokojowej (RT) lub przez 1–2 godziny w sterylnym pomieszczeniu ogrzewanym w temperaturze 100-120 °C, aby przyspieszyć suszenie.
   3. Sterylizuj pipety w standardowym autoklawie w szczelnie zamkniętej torbie do autoklawu.
3. Przygotować 96-dołkowe płytki pokryte poli-L-ornityną (PO) z przezroczystym dnem, dodając 60 μl roztworu PO do środkowych dołków płytki 96-dołkowej, która ma być użyta do wysiewu neuronów, pozostawiając co najmniej jeden rząd/kolumnę studzienek na krawędziach płytki, aby uniknąć efektów krawędziowych. Powlekaną płytkę należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub 4 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Przed posiewem komórek należy całkowicie odessać PO i trzykrotnie przemyć komórki 100 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zassać 1x PBS z dołków i pozostawić pokrywę płytki otwartą do całkowitego wyschnięcia.
   nuta: Możliwe jest zebranie zużytego zamówienia zakupu i przefiltrowanie go pod kątem ponownego wykorzystania. Można to powtórzyć dwukrotnie dla tego samego rozwiązania PO.
5. Dodać 50 μl DPM do wcześniej pokrytych studzienek. Odessać DPM ze studzienek za pomocą plastikowej końcówki o pojemności 100 μl i jednocześnie zarysować dno studzienki okrężnymi ruchami, aby usunąć powłokę na obwodzie każdej studzienki. Na środku studni pozostanie wyspa pokryta PO.
6. Pod pokrywą laminarną dodaj 10 μl DPM na środek każdej powlekanej wyspy, aby utworzyć mikrowyspy.
   nuta: Płytka z mikrowyspami pokrytymi DPM może być przechowywana pod okapem z przepływem laminarnym przez 1–2 godziny podczas izolacji komórek

2. Izolacja brzusznego dna śródmózgowia od embrionalnej dna 13.5 (E13.5) zarodków myszy

1. Przed rozbieraniem należy napełnić 10-centymetrową szalkę Petriego buforem Dulbecco i trzymać ją na lodzie.
2. Poddaj eutanazji ciężarną samicę myszy E13,5 zgodnie z wytycznymi instytucji. Połóż mysz płasko na plecach i spryskaj przednią część ciała 70% etanolem. Podnieś skórę nad macicą za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić macicę.
3. Ostrożnie wyjmij macicę i umieść ją na wcześniej przygotowanej szalce Petriego na lodzie.
4. Używając nożyczek chirurgicznych pod kapturem laminarnym w RT, ostrożnie usuń zarodki z macicy. Usunąć wszystkie pozostałości łożyskowe z zarodków za pomocą kleszczy i umieścić je na nowej 10 cm szalce Petriego wypełnionej buforem Dulbecco.
5. Za pomocą kleszczy lub igieł preparacyjnych odciąć tylną ćwiartkę głowy od miejsc oznaczonych czarnymi strzałkami na rysunku 1A. Odciąć kawałek od reszty zarodka (ryc. 1B).
6. Umieść tylną część wyciętego kawałka w kierunku obserwatora (ryc. 1C) i delikatnie rozetnij go od ogona do czaszki (ryc. 1D). Od 0,5 mm poniżej otworu czaszki wytnij obszar 2 mm² –3 mm², pokazany na rysunku 1E.
7. Zebrać brzuszne dno śródmózgowia (patrz rysunek 1F) do pustej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę wirówki na lodzie, aż wszystkie podłogi śródmózgowia zostaną w niej zebrane.
   nuta: Alternatywnie, dno śródmózgowia można pobrać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml po wypreparowaniu wszystkich mózgów zarodków.

3. Zakładanie pierwotnych embrionalnych kultur śródmózgowia z zarodków myszy E13.5 w formacie płytki 96-dołkowej

1. Po zebraniu dna śródmózgowia od wszystkich zarodków w tej samej probówce o pojemności 1,5 ml, usuń resztki buforu Dulbecco i przemyj kawałki tkanki trzykrotnie 500 μl Ca2⁺, wolnego od Mg2⁺ roztworu soli Hanka (HBSS).
2. Usuń HBSS i dodaj 500 μl 0,5% trypsyny do probówki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. Podczas inkubacji ogrzać 1,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C, dodać 30 μl DNazy I do FBS i wymieszać. Wypoleruj również ogniowo końcówkę pipety ze szkła silikonowanego. Upewnij się, że otwór nie ma ostrych krawędzi i jest mniej więcej tego samego rozmiaru co końcówka do mikropipet o pojemności 1 ml.
   nuta: Alternatywnie do rozcierania można użyć końcówki do mikropipet o niskiej przyczepności 1 ml. Jednak pipety ze szkła silikonowanego wydają się dawać najlepsze rezultaty.
4. Jak tylko inkubacja w kroku 3.2 zakończy się, dodać 500 μl mieszaniny FBS/DNazy do częściowo strawionej tkanki. Użyj szklanej pipety, aby rozcierić tkankę w mieszance FBS / trypsyny. Tryturuj, aż tkanki rozpadną się na małe, ledwo widoczne cząstki. Unikaj pęcherzyków podczas rozcierania.
5. Pozwól, aby resztki cząstek wytrąciły się grawitacyjnie na dnie probówki mikrowirówkowej. Nie pipetując osadu na dnie, zebrać supernatant do pustej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
6. Rozcieńczyć FBS/DNazę I z kroku 3.3 (98:2) 1,000 μl HBSS, aby uzyskać FBS/DNazę-I/HBSS (49:1:50). Mieszać, pipetując w górę i w dół. Dodać 1 000 μl nowej mieszanki do pozostałych cząstek w probówce do mikrowirówki. Ponownie rozcierać i powtórzyć krok 3.5.
7. Powtórz poprzedni krok jeszcze raz, aby zużyć wszystkie FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Gdy cały supernatant zostanie zebrany w probówce o pojemności 15 ml (z kroków 3.5, 3.7 i 3.8), użyj wirówki stołowej, aby odwirować supernatant (~3 ml) przy 100 x g, przez 5 minut. Usuń supernatant bez dotykania granulowanych komórek na dole.
9. Umyj osad komórkowy, dodając 2 ml DPM do probówki i odwiruj go w tempie 100 x g przez 5 minut. Usuń supernatant i powtórz mycie 2x, aby zminimalizować zanieczyszczenia w granulowanych komórkach.
   nuta: Zawsze używaj świeżego, podgrzanego DPM dla hodowanych neuronów. Na etapie prania DPM nie musi być świeży, ale powinien być wstępnie podgrzany do 37 °C.
10. Rozcieńczyć komórki świeżym, ciepłym DPM i przenieść je do probówki mikrowirówkowej. Ilość DPM do rozcieńczenia zależy od liczby zarodków użytych do rozwarstwienia tkanki. Na przykład użyj 150 μl DPM do rozcieńczenia komórek uzyskanych z dziesięciu zarodków.
11. Przenieść 10 μl komórek w DPM do probówki mikrowirówkowej. Wymieszaj je z 10 μl 0,4% niebieskiej plamy trypanowej. Policz żywe (tj. Trypan blue ujemne) komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    nuta: Użyj 30 000 komórek do posiewu na studzienkę, aby uzyskać ~ 1 000 neuronów dopaminowych na dołek. Jeśli gęstość komórek jest wyższa niż ~ 30 000 komórek na 6 μl, przed posiewem należy dodatkowo rozcieńczyć komórki DPM, aby objętość wysiewu była nie mniejsza niż 6 μl.
12. Nie dotykając dna studzienek, usuń DPM z mikrowysp utworzonych w kroku 1.6.
13. W celu uzyskania powtarzalnej gęstości komórek w każdym dołku, przed posiewem w studzience należy wymieszać komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Za pomocą mikropipety o pojemności 1–10 μl dodaj 6 μl komórek do środka studzienki, w miejscu, w którym znajdowała się każda poprzednia mikrowyspa.
14. Napełnij puste studzienki na krawędziach płytki 150 μl wody lub 1x PBS, aby zminimalizować parowanie z dołków zawierających kultury neuronów. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1 godzinę.
15. Po 1 godzinie wyjąć płytkę z inkubatora, dodać 100 μl DPM do każdej studzienki z komórkami i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.
16. Dwa dni po posiewie (dzień in vitro 2 lub DIV2) usunąć 25 μl i dodać 75 μl świeżego DPM, aby doprowadzić końcową objętość pożywki do 150 μl i w miarę możliwości uniknąć parowania.
17. Wymień połowę pożywki na świeżą DPM (tj. usuń 75 μl i dodaj 75 μl świeżego DPM) w DIV5. Nie wykonuj żadnych zmian nośników po DIV5.

Rycina 1: Wycięcie dna śródmózgowia z zarodka myszy E13.5. (A) Miejsca cięcia w tylnej ćwiartce głowy są oznaczone czarnymi strzałkami i białymi liniami przerywanymi. (B) Fragment został usunięty z reszty zarodka. Usunięty fragment jest zakreślony. (C) Pionek został obrócony o 90° tak, aby był skierowany do tyłu w kierunku obserwatora. (D) Kawałek ten był otwarty od czarnych strzał, od ogona do czaszki (oznaczonych białą przerywaną linią). (E) Od 0,5 mm do 1 mm poniżej otworu wycięto obszar 2 mm2 –4mm2 (zaznaczony czarnymi liniami). (F) Brzuszne dno śródmózgowia było izolowane (oznaczone czarnym przerywanym kwadratem). Podziałka = 1 mm.