Rozwarstwienie i montaż eksplantatów mózgu larw muszki owocowej

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Preparowanie i montowanie eksplantatów mózgów larw

1. Wypreparować mózgi larw w fizjologicznym roztworze soli zewnętrznej (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM glukozy, 10 mM sacharozy, 5 mM kwasu N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-2-aminoetanosulfonowego (TES), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7,2) pod mikroskopem preparacyjnym (4,5-krotne powiększenie) z dwiema parami standardowych kleszczy preparacyjnych #5 (11 cm). Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać ciało larwy na miejscu, a drugiej, aby ostrożnie wyciąć mózg. Zachowaj dyski oczne, płaty mózgowe i brzuszny rdzeń nerwowy. Usuń przyczepione mięśnie, aby zminimalizować ruchy próbki podczas obrazowania.
2. Przygotuj szkiełko podstawowe (25 x 75 x 1,0 mm³) i za pomocą strzykawki narysuj kwadratową komorę z tłuszczem próżniowym.
3. Dodać 20 μl zewnętrznego roztworu soli fizjologicznej do kwadratowej komory z barierami przeciwtłuszczowymi.
4. Wypreparowane mózgi larwalne przenieść do komory na szkiełku za pomocą kleszczy. Dostosuj położenie mózgów pod lunetą preparacyjną, aby upewnić się, że strona grzbietowa jest skierowana do góry.
5. Przykryj komorę szklanym szkiełkiem nakrywkowym (22 x 22 x 0,15 mm³). Mózg larwy jest teraz zamontowany na szkiełku w komorze wypełnionej zewnętrznym roztworem soli fizjologicznej (ryc. 1B).
   nuta: Delikatne naciskanie na szkiełko nakrywkowe ogranicza mózg i zmniejsza dryfowanie próbki podczas kolejnej sesji obrazowania.

Rysunek 1: Przebieg pracy protokołu obrazowania i kwantyfikacji dynamiki dendrytów. (A) Protokół zawiera sześć etapów obejmujących przygotowanie próbki, pobieranie obrazu, przetwarzanie obrazu i półautomatyczne oznaczanie ilościowe dynamiki dendrytów. (B) Schematyczny schemat ilustrujący komorę obrazowania zawierającą eksplant mózgu larwalnego zamontowany stroną grzbietową do góry. Eksplant mózgu ma indywidualnie znakowany brzuszny neuron boczny (LNv) w każdym płacie i jest zanurzony w zewnętrznym roztworze soli fizjologicznej. Próżniowe bariery tłuszczowe utrzymują ciężar szkiełka nakrywkowego i tworzą małą komorę, która zapobiega ruchom mózgu.