Różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Streszczenie

Źródło: Phillips, A. W., et al. Opracowywanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur komórek macierzystych 3D przy użyciu fizjologicznie istotnych testów. J. Vis. Exp. (2017).

Film demonstruje technikę różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w neuronalne komórki progenitorowe (NPC). Początkowo hiPSC są hodowane na warstwie zasilającej mysich fibroblastów embrionalnych (MEF). Następnie komórki są odłączane i przenoszone na płytkę pokrytą biopolimerem, aby umożliwić MEF-y przyleganie do hiPSC i oddzielenie się od nich. Zawieszone hiPSC są następnie przenoszone na płytkę z dnem w kształcie litery V i odwirowywane w celu utworzenia agregatów. Wreszcie, dodanie pożywki różnicującej indukuje różnicowanie się hiPSC w obrębie agregatu w NPC.

Protokół

1. Generacja nerwowych komórek progenitorowych

1. Utrzymuj hiPSC pochodzące z fibroblastów i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w 6-dołkowych płytkach na napromieniowanej γ warstwie komórek embrionalnych myszy (MEF) w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej małymi cząsteczkami.
   UWAGA: Codzienna konserwacja jest zmodyfikowaną wersją wcześniej zgłaszanych procedur.
   1. Płytkę 6 x 10⁵ MEF na każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w zalecanej pożywce 300 μl/basenik (zgodnie z protokołem producenta).
   2. Po 48 godzinach zastąp pożywkę MEF pożywką o pojemności 300 μl/studzienkę hiPSC na 1 godzinę przed dodaniem hiPSC.
   3. Szybko rozmrozić hiPSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i powoli dodawać kroplami 1 ml pożywki hiPSC. Przenieść hiPSC i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość do 5 ml. Wirować przez 4 minuty przy 129 x g, odessać supernatant, delikatnie zawiesić osad w 1 ml pożywki hiPSC z inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) w stężeniu 1:1,000.
   4. Zawiesinę komórkową (zwykle wysianą w 300 000 komórek/dołk) należy umieścić na warstwie komórek MEF i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, wilgotności 95%.
   5. Uważnie monitoruj hodowlę iPSC za pomocą mikroskopu świetlnego. Po 48 godzinach usuń kultury, które mają nierówne krawędzie, stały się torbielowate lub wydają się żółtawo-brązowe pod mikroskopem świetlnym, aby zminimalizować spontaniczne różnicowanie.
      nuta: Po 7 - 10 dniach powinny powstać kolonie hiPSC. Kolonie powinny być okrągłe, z wyraźnie zaznaczonymi granicami i jednolitą gęstością komórek oraz pozbawione luźno upakowanych niejednorodnych komórek.
   6. Ręcznie wybierz okrągłe kolonie hiPSC, aby oczyścić kulturę spontanicznie różnicujących się komórek. Rozszerz kolonie, umieszczając je na świeżych warstwach MEF. Rozszerzaj się 1:3 co 7 dni, gdy kultury zbliżają się do zbiegu i zamarzają.
2. Po ekspansji i zamrożeniu komórek (w celu kopii zapasowej) hoduj kolonie hiPSC na płytkach, aż osiągną 50 - 75% konfluencji.
3. Siedem dni po posiewie należy zastosować łagodną obróbkę enzymatyczną (5-10 minut z 300 μl roztworu enzymatycznego) i delikatne rozcieranie (2-4 razy pipetą o pojemności 1 000 μl) w celu zebrania i przygotowania hiPSC do różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych.
4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 129 x g przez 4 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml ludzkiej pożywki iPSC. Przenieść zawiesinę komórkową do pokrytego 0,1% żelatyną naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 5 cm na 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania MEF i maksymalizacji wydajności hiPSC. Przenieś podłoże (z nieprzylegającymi komórkami) do innego naczynia pokrytego żelatyną o średnicy 5 cm.
5. Przenieść nieprzylegające komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej. Delikatnie opłucz płytki 3 ml pożywki i dodaj je do probówki o pojemności 15 ml.
6. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 129 x g przez 4 minuty, odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad w pożywce. Określ liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Płytka 9,000 komórek / studzienka w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V o niskiej przyczepności.
7. Odwirować płytkę przy sile 163 x g przez 3 minuty. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%_CO2. Za pomocą pipety zmieniaj 50% pożywki co drugi dzień, usuwając połowę pożywki i zastępując ją świeżą, chemicznie zdefiniowaną pożywką różnicującą 1 (DM1; Rysunek 1; Tabela materiałów) przez 14 dni.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat przedstawiający wczesne etapy przygotowania SFEB. Po zebraniu iPSC za pomocą dysocjacji enzymatycznej posiewa się je na 96-dołkowych płytkach i odwirowuje przy 163 x g przez 3 minuty w celu wywołania szybkiej agregacji. Po 14 dniach agregaty komórkowe in vitro (DIV) można przenieść z płytek 96-dołkowych za pomocą pipet o szerokim otworze na płytki 6-dołkowe zawierające wkładkę do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SFEB Różnicowanie neuronów Pożywka do hodowli komórkowych. Odczynniki. Składniki
Pożywka do indukcji neuronalnej STEMdiff (pożywka hiPSC)	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 0-5835	Pojemność 250ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	Globalny Stem	GSM-2001
Komponenty multimedialne DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax płyn, 1:1	Invitrogen	10565018	Pojemność 385ml
Wymiana serum nokautującego	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Pióro/Paciorkowiec	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
MEM Roztwór aminokwasów endogennych 10 mM (100X), płyn	Invitrogen	11140050	5ml
2-merkaptoetanol (1,000X), płynny	Invitrogen	21985023	900ul
Małe cząsteczki
Y27632 (ROCKi)	Stemgent (Łodyga	04-0012-10	10uM
Komponenty/Materiały
Fibroblasty embrionalne myszy	Globalny Stem	GSC-6301G
96 dołków V z pokrywkami	zimozielony	222-8031-01V
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek	Rybak termiczny	A1110501
6 dołków z płaskim dnem	sokół	353046