Rozwój i utrzymanie ciał zarodkowych wolnych od surowicy

Streszczenie

Źródło: Phillips, A. W., et al. Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologicically Relevant Astests. J. Vis. Exp. (2017).

Film opisuje procedurę tworzenia ciał embrionalnych wolnych od surowicy (SFEB) z komórek progenitorowych neuronów przy użyciu różnych pożywek różnicujących bez surowicy lub DM. DM-2 ułatwia dojrzewanie i układanie neuronów do tworzenia SFEB, podczas gdy DM-3 jest używany do dalszego utrzymania wzrostu.

Protokół

1. Indukcja ciała zarodka bez surowicy (SFEB) (Rysunek 1)

1. Umieścić 40 μm wkładek do hodowli komórkowych na płytkach 6-dołkowych i dodać 1 ml pożywki różnicującej 1 (DM1) (tabela materiałów) co najmniej 1 godzinę przed dodaniem kruszyw.
2. Przenieś agregaty nerwowych komórek progenitorowych z pożywką o pojemności 20 μl za pomocą końcówki o szerokości 200 μl na wkładki do hodowli komórkowych 40 μm i zmień pożywkę na DM2 (tabela materiałów).
   nuta: Wkładki do hodowli komórkowych to specjalistyczne wkładki, które są lekko odstawione od dna studzienki i składają się z membrany politetrafluoroetylenowej zawieszonej na plastikowej ramie. Membrana ta jest biokompatybilna i może skutecznie podtrzymywać transport składników odżywczych i tlenu do SFEB umieszczonych na górze. Są one powszechnie stosowane z organotypowymi kulturami plastrów hipokampa pobranymi od myszy lub szczura.
   1. Przenieść 4-6 agregatów do jednej wkładki do hodowli komórkowej i pozostawić odpowiednią przestrzeń między agregatami. Usuń jak najwięcej nadmiaru roztworu za pomocą cienkiej końcówki do pipet (np. końcówki 200 μl).
      UWAGA: Dopuszczalne jest krótkotrwałe zakłócenie SFEB, ponieważ będą się one przemieszczać po wkładce do hodowli komórkowej, gdy roztwór jest usuwany z okolic SFEB.
   2. Utrzymuj kultury w 1 ml DM2 w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2. Za pomocą pipety zmieniaj 75% pożywki co drugi dzień, usuwając trzy czwarte pożywki i zastępując ją trzema czwartymi świeżej pożywki. Na przykład usuń 750 μl pożywki i dodaj 750 μl świeżej pożywki.
3. Po 14 dniach hodowli należy przejść na pożywkę DM3 (Tabela Materiałów) z 75% wymianą pożywki co drugi dzień i przez kolejne 16 dni.
4. Aby utrzymać SFEB na wkładkach do hodowli komórkowych dłużej niż 30 dni, należy zmieniać pożywkę co drugi dzień przez 60, 90 i 120 dni.
   nuta: SFEB osiągają średnicę około 1000 μm i zwykle mają grubość 100-150 μm.
5. Odłącz SFEB od wkładu, delikatnie pipetując pożywkę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl z szeroką formułą. Aby przenieść SFEB, użyj końcówki pipety z szeroką końcówką, aby delikatnie zassać korpusy do końcówki pipety. Po załadowaniu SFEB do końcówki pipety, delikatnie przenieść do płytek 12-dołkowych i przemyć 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na studzienkę.

Wyniki

Rysunek 1: Kalendarium średnich zmian i faz podczas wzrostu i ekspansji SFEB.

Po przeniesieniu SFEB do wkładek, przechodzą one dwie zmiany podłoża po 14 i 28 dniach in vitro (DIV). Są one zwykle zbierane do eksperymentów w DIV 30, 60 i 90. Górne wstawki pokazują różne fazy tego procesu. Podziałka = 1 000 μm (skrajnie po lewej); 1 000 μm (DIV 20); 600 ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SFEB Różnicowanie neuronów Pożywka do hodowli komórkowych. Odczynniki. Składniki
Pożywka do indukcji neuronalnej STEMdiff (pożywka hiPSC)	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 0-5835	Pojemność 250ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	Globalny Stem	GSM-2001
Komponenty multimedialne DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax płyn, 1:1	Invitrogen	10565018	Pojemność 385ml
Wymiana serum nokautującego	Invitrogen	10828028	20% 100ml
Pióro/Paciorkowiec	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
MEM Roztwór aminokwasów endogennych 10 mM (100X), płyn	Invitrogen	11140050	5ml
2-merkaptoetanol (1,000X), płynny	Invitrogen	21985023	900ul
Komponenty multimedialne DM2
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax płyn, 1:1	Invitrogen	10565018	Pojemność 500ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Pióro/Paciorkowiec	Invitrogen	15140122	5ml
Suplement N-2 (100X), płynny	Invitrogen	17502048	10ml
Komponenty multimedialne DM3
NEUROBASAL Medium (1X), płyn	Invitrogen	21103049	Pojemność 500ml
B-27 Suplement Minus Witamina A (50X), płyn	Invitrogen	12587010	10ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Pióro/Paciorkowiec	Invitrogen	15140122	5ml
Komponenty/Materiały
	Milikomórka	PICM0RG50
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Rybak termiczny	10010023	500 ml