Konstruowanie wzorzystych obwodów neuronalnych na matrycy wieloelektrodowej

Streszczenie

Źródło: Kanner, S., et al. Projektowanie, obróbka powierzchniowa, powlekanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje proces hodowli komórek neuronalnych na schemacie wieloelektrodowym (MEA) w celu stworzenia modułowych sieci neuronowych. Metoda ta pozwala na badanie transmisji sygnału neuronalnego i interakcji komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie matrycy wieloelektrodowej (MEA)

1. Wyczyść MEA w tej kolejności (tabela materiałów):
   1. Umyć wodą pod bieżącą wodą i 3 razy poddać sonikacji w skoncentrowanym, enzymatycznym detergencie.
   2. Sonikuj w wodzie destylowanej 3 razy.
   3. Umyć wodą destylowaną (w kapturze, końcówka 1 000 μl) 3 razy i umieścić w ultrafiolecie (UV) na 30 minut.
2. Wspieranie przygotowania sieci:
   1. Przygotuj zaprojektowaną formę sieci wsporczej.
      1. Wlać polidimetylosiloksan (PDMS) do płytki 12-dołkowej (o średnicy 22 mm).
      2. Gdy PDMS stwardnieje, usuń formę i za pomocą skalpela wytnij otwór w środku, aby utworzyć kształt pierścienia.
      3. Umieść zaprojektowaną formę sieci nośnej na środku MEA (rysunek 1A) i przykryj resztę powierzchni poli-D-lizyną (PDL) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
   2. Usuń PDL za pomocą pipety i przemyj wodą destylowaną.
   3. Wyjmij formę i pozostaw do wyschnięcia (Rysunek 1A).
3. Dopasuj szablon do MEA w następujący sposób:
   1. Umieść szablon na wyznaczonym mikromanipulatorze. Użyj odwróconego mikroskopu, aby dokładnie wyrównać wzorzystą strukturę do elektrod i opuść szablon, aż zostanie umieszczony na powierzchni MEA (Rysunek 1B).
      nuta: Kontakt z dobrze oczyszczonym MEA zapewnia konkurencyjną przyczepność między PDMS a samym MEA.
   2. Podnieś mikromanipulator i, jeśli to konieczne, użyj pęsety, aby wywrzeć niewielki nacisk nad PDMS, aby zapobiec jego odłączeniu się od MEA.
   3. Delikatnie dociśnij szablon do powierzchni MEA i użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy jest mocno przymocowany i dobrze wyrównany (Rysunek 1C-D).
4. Umieścić MEA w komorze próżniowej na 15 minut; nanieść 1 ml kropli PDL na szablon.
5. Włóż do komory próżniowej 2 razy po 20 minut. Pozostawić PDL do wyschnięcia O/N w inkubatorze.
6. Przed poszyciem należy usunąć szablony PDMS z MEA i umyć je sterylną wodą. Umieścić w świetle UV na 7 minut.

2. Poszycie

1. Oblicz liczbę komórek potrzebnych do posiewu za pomocą hemocytometru
   1. Upewnij się, że komora licząca (hemocytometr) jest czysta i umieść na niej szkiełko nakrywkowe (do czyszczenia użyj alkoholu).
   2. Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek w 190 μl pożywki galwacyjnej (rozcieńczenie 1:20).
   3. Załadować 10 μl rozcieńczonych komórek na krawędź komory liczenia i powoli odpipetować komórki, pozwalając komorze napełnić się sama.
   4. Za pomocą odwróconego mikroskopu zwizualizuj siatkę hemocytometru. Określ liczbę komórek w komorze przez bezpośrednie liczenie (zdrowe komórki powinny być okrągłe). Policz komórki w dużym kwadracie bez tych, które przecinają krawędzie.
   5. Oblicz stężenie komórek:
      Całkowita liczba komórek/1000 μl = Całkowita liczba komórek × współczynnik rozcieńczenia ×^{10 4} (powierzchnia hemocytometru).
      nuta: Na przykład, jeśli współczynnik rozcieńczenia wynosił 20, a całkowita liczba zliczonych komórek wynosiła 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ komórek/1 000 μl lub 1 x 10⁶/100 μl. Aby pokryć 6 komórek 0,75 x 10, należy pobrać z komórek 75 μl.
2. Weź liczbę komórek potrzebnych do posiewu na pojedynczą szalkę MEA lub Petriego, ponownie zawieś komórki, aby zapobiec agregacji, i umieść je w środku, na wierzchu wzorzystego obszaru (w razie potrzeby komórki można rozcieńczyć w pożywce). W przypadku MEA umieść kroplę o pojemności 100 μl na środku. W przypadku szkiełka nakrywkowego umieść kroplę o pojemności 1 000 μl na środku.
3. Inkubować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Dodać pożywkę galwaniczną do posianych komórek, do 1 ml na MEA i 2 ml na szkiełko nakrywkowe.
4. Przechowywać w temperaturze 37 °C i rozcieńczać świeżym podłożem wzbogaconym o 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 i 0,75% glutamax co 4 dni.
5. Od 6/7 DIV, po zaobserwowaniu połączeń między wyspami, rozcieńczyć pożywkę 10 μl/ml FUDR (25 mg deoksyurydyny + 62,5 mg urydyny w 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) lub innym środkiem antymitotycznym, aby zapobiec przerostowi gleju.

Wyniki

Rysunek 1. Osadzanie struktur PDMS na MEA. (A) Forma PDMS w kształcie pierścienia (oznaczonego czerwoną strzałką) zamontowana na MEA. Pleśń służy do pokrycia obszaru przeznaczonego dla podtrzymującej sieci neuronalnej i znajdującego się na obrzeżach obszaru hodowli (jest to ograniczone pierścieniem zamontowanym na MEA i oznaczonym zieloną strzałką). (B) Wyrównanie szablonu PDMS n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS, ul. Sylgard 184	Dow Corning
Komora próżniowa Nalgene	Thermo	5305-0609
Poli-D-lizyna PDL	Sigma	Zobacz materiał P7886
12-dołkowa płytka hodowlana	Sigma	CLS3336
5-fluoro-2'-deoksyurydyna	Sigma	F0503
MEA1060-INV-BC	Systemy wielokanałowe
Zobacz materiał TC02	Systemy wielokanałowe
Pióro Strep	Przemysł biologiczny Beit Haemek	03-033-1C
B-27	Gibco (firma Gibco)	17504044
glutaMAX	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle (Minimalny niezbędny średni orzeł)	Przemysł biologiczny Beit Haemek	01-025-1B
Matryce mikroelektrod 4Q	Systemy wielokanałowe	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	Instrukcja czyszczenia: http://www.multichannelsystems.com

TGL powiedział: