Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne neurony ruchowe

Abstract

Źródło: Garone, M. G., et al. Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki za pomocą wektorów PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje proces różnicowania ludzkich iPSC w neurony ruchowe. Uzasadnienie obejmuje wykorzystanie iPSC, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych. Po wyhodowaniu w pożywce zawierającej doksycyklinę, antybiotyk ten wyzwala ekspresję czynników transkrypcyjnych, promując w ten sposób różnicowanie iPSC w komórki progenitorowe neuronów ruchowych. Ostatecznie przodkowie są hodowani w pożywce neuronalnej, aby uzyskać dojrzałe i funkcjonalne neurony ruchowe.

Protocol

1. Utrzymanie ludzkich iPSC

1. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą
   1. Rozmrozić jedną fiolkę o pojemności 5 ml z matrycą (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc. Oryginalne zapasy matrycowe występują w różnych stężeniach, a podwielokrotności są sporządzane zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia wskazanym w arkuszu danych i są specyficzne dla danej partii. Bardzo ważne jest, aby fiolka i probówki były lodowate, aby zapobiec przedwczesnemu zżelowaniu matrycy. Dozować matrycę do podwielokrotności we wstępnie schłodzonych krioprobówkach na lodzie. Niewykorzystane podwielokrotności zamrozić w temperaturze -20 °C.
   2. Umieść jedną porcję na lodzie na około 2 godziny do rozmrożenia.
   3. Rozcieńczyć podwielokrotność matrycy 20 ml zimnego DMEM/F12 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
   4. Dobrze wymieszać i rozlać 1 ml rozcieńczonej matrycy do szalek o średnicy 35 mm (równoważne ilości na powierzchnię innych szalek).
   5. Naczynia zawierające rozcieńczoną matrycę należy przechowywać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić powlekanie.
      nuta: Naczynia uszczelnione parafilmem można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
2. Przygotowanie roztworu podstawowego (20 ml) i 1x porcji roboczych delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów).
   1. Rozpuścić proszek do 10 mg/ml w PBS (bez Ca²⁺/Mg²⁺)
   2. Filtr sterylizuje przez membranę filtracyjną 0,22 μm.
   3. Przygotować 20 porcji (po 1 ml każdy) i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
   4. Przed użyciem rozcieńczyć jedną podwielokrotność w PBS (wolne od Ca²⁺/Mg²⁺) do 1 mg/ml (1x podwielokrotności robocze).
      UWAGA: 1x porcje robocze mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
3. Przenikanie ludzkich komórek iPS.
   1. Przed rozpoczęciem: W przypadku przechowywania w temperaturze 4 °C należy wstępnie ogrzać płytki pokryte matrycą w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20-30 min. Wstępnie podgrzej w temperaturze pokojowej ilość potrzebnej pożywki iPSC dla ludzi (patrz Tabela materiałów). Wstępnie rozgrzej DMEM/F12.
   2. Aspirować pożywkę hodowlaną.
   3. Przepłukać iPSC PBS (wolne od Ca²⁺/Mg²⁺).
   4. Dodaj 1x delikatny roztwór dysocjacyjny (0,5 ml na naczynie 35 mm). Inkubować w temperaturze 37 °C, aż krawędzie kolonii zaczną odrywać się od płytki, zwykle 3-5 minut.
   5. Zassać delikatny roztwór dysocjacyjny, uważając, aby nie oderwać kolonii iPSC.
   6. Umyj komórki DMEM/F12 (2 ml na naczynie 35 mm) i aspiruj, uważając, aby nie odłączyć komórek. Powtórz ten krok jeszcze raz.
   7. Dodać ludzką pożywkę iPSC (1 ml na szalkę o średnicy 35 mm).
   8. Delikatnie odłącz kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml.
   9. Delikatnie rozbić grudki komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.
   10. Odessać supernatant z płytki(-ek) pokrytej matrycą(-ych).
   11. Wysiewać komórki w odpowiedniej objętości hodowli ludzkiej pożywki iPSC. Współczynnik podziału może się różnić w zależności od wiersza i wynosi około 1:4-1:8. Zmieniaj medium codziennie.

2. Generowanie indukowanych przez NIL i NIP linii iPSC

1. Transfekcja komórek
   1. Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca²⁺ / Mg²⁺).
   2. Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż pojedyncze komórki zostaną oddzielone (5-10 min).
   3. Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.
   4. Zebrać w probówce o pojemności 15 ml i dodać PBS (wolny od Ca²⁺ / Mg^{2 +}) do 10 ml. Policz komórki.
   5. Osad 10⁶ ogniw i ponownie zawiesić w 100 μl buforu R (dołączonego do zestawu do elektroporacji ogniw; patrz tabela materiałów).
   6. Dodaj plazmidowe DNA do transfekcji: 4,5 μg wektora transpozycyjnego (epB-Bsd-TT-NIL lub epB-Bsd-TT-NIP12) i 0,5 μg plazmidu transpozazy piggyBac.
   7. Transfekcja za pomocą systemu elektroporacji ogniw (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta i zgodnie z wcześniejszym opisem z następującymi parametrami: napięcie 1 200 V, szerokość 30 ms, 1 impuls. Wysiewać komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK, patrz tabela materiałów) w naczyniu pokrytym matrycą o średnicy 6 mm.
2. Selekcja z antybiotykami
   1. Dwa dni po transfekcji dodać 5 μg/ml blasticydyny do pożywki hodowlanej.
   2. Większość komórek nietransfekowanych umrze w ciągu 48 godzin od selekcji blasticydyny. Utrzymuj komórki w blasticydynie przez co najmniej 7-10 dni, aby dokonać kontrselekcji komórek, które nie zintegrowały transgenów z genomem.
   3. Utrzymuj stabilnie transfekowane komórki jako populację mieszaną, złożoną z komórek o różnej liczbie transgenów i różnych miejscach integracji, lub izoluj pojedyncze klony.
   4. Przygotować dodatkowe naczynie w celu sprawdzenia skutecznej ekspresji transgenów po indukcji doksycykliny 1 μg/ml metodą RT-PCR ze starterami specyficznymi dla transgenu dla Ngn2 (Naprzód: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Rewers: GAAGGGAGGGGGCTCGACT).
   5. Na tym etapie należy zamrozić zapasy nowych linii NIL i NIP-iPSC w pożywce do zamrażania dla ludzkich iPSC (patrz tabela materiałów).

3. Różnicowanie neuronów ruchowych

1. Oddzielić komórki za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek, jak opisano (kroki 2.1.1.-2.1.3.). Zebrać zdysocjowane komórki w probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć 5 objętościami DMEM/F12. Osadzać komórki i ponownie zawiesić w ludzkim pożywce iPSC uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Policz komórki i nasiona na szalkach pokrytych matrycą o gęstości 62 500 komórek/^cm2.
2. Następnego dnia zastąp pożywkę DMEM/F12, uzupełnioną 1x stabilnym analogiem L-glutaminy, 1x suplementem do hodowli komórkowych aminokwasów endogennych (NEAA) i 0,5x penicyliną/streptomycyną, zawierającą 1 μg/ml doksycykliny. Jest to traktowane jako dzień 0 różnicowania. W dniu 1 odśwież pożywkę i doksycyklinę.
3. W dniu 2 zmień pożywkę na pożywkę Neurobasal/B27 (pożywka neuropodstawowa uzupełniona 1x B27, 1x stabilny analog L-glutaminy, 1x NEAA i 0,5x penicylina/streptomycyna), zawierającą 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 i 1 μg/ml doksycykliny (patrz Tabela materiałów). Odświeżaj pożywkę i doksycyklinę codziennie aż do 5 dnia.
4. Dzień 5: Dysocjacja komórek za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela materiałów).
   1. Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca²⁺ / Mg²⁺).
   2. Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż cała monowarstwa komórek oddzieli się od szalki.
      UWAGA: pojedyncze komórki nie zostaną oddzielone podczas inkubacji.
   3. Dodać 1 ml DMEM/F12 i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.
   4. Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 10-15 razy.
   5. Dodaj 4 ml DMEM/F12 i policz komórki.
   6. Na tym etapie należy zamrozić komórki progenitorowe neuronów ruchowych w pożywce do zamrażania komórek (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
   7. Osadzać komórki i ponownie zawiesić w pożywce neuronalnej (pożywka Neurobasal/B27 uzupełniona 20 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF i 200 ng/ml kwasu L-askorbinowego, patrz tabela materiałów) uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK.
   8. Wysiewaj komórki na poli-ornitynie/lamininie lub alternatywnie na podłożach pokrytych matrycą o gęstości 100 000 komórek/^cm2. Do analizy barwienia immunologicznego należy użyć plastikowych podpór μ-Slide z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym (patrz Tabela materiałów).
5. W 6 dniu zmień pożywkę na świeżą pożywkę neuronalną pozbawioną inhibitora ROCK. W kolejnych dniach odświeżaj połowę podłoża co 3 dni. Pożywkę hodowlaną należy zmieniać bardzo ostrożnie, aby zapobiec oderwaniu się od powierzchni.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dokładności	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Odczynnik do dysocjacji komórek
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplement bez surowicy do utrzymania komórek neuronalnych
Bambanker (Bambanker)	Genetyka Nippon	NGE-BB02	Pożywka do zamrażania komórek, stosowana tutaj do komórek progenitorowych neuronów ruchowych
BDNF powiedział:	PrzedproTech	Rozdział 450-02	Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego
Blasticydyna	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 203350	Antybiotyk nukleozydowy hamujący syntezę białek u prokariontów i eukariontów
Bsa	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2153	Albumina surowicy bydlęcej. Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach barwienia immunologicznego
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C3881	Chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Corning Matrigel z certyfikatem hESC Matrix	Corning	354277	Chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
POŻYWKI DO ZAMRAŻANIA CRYOSTEM ACF	Przemysł biologiczny	05-710-1E	Pożywka do zamrażania ludzkich komórek iPS
D-glukoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5146	Chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
DAPT (Język	AdipoGen powiedział:	AG-CR1-0016-M005	Inhibitor gamma sekretazy
Rozpuść	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17105-041	Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Podstawowa pożywka do hodowli komórkowej
Doksycyklina	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Służy do indukowania ekspresji transgenów z wektorów epB-Bsd-TT-NIL i epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell (komórka WiCell)	UWWC1-DS2U	Komercyjna linia iPSC dla ludzi
Certyfikat GDNF	PrzedproTech	450-10	Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego
Linia Gibco Episomal hiPSC	Thermo Fisher Naukowy	A18945	Komercyjna linia iPSC dla ludzi
Glutamax (Glutamax)	Thermo Fisher Naukowy	35050038	Alternatywa dla L-glutaminy o zwiększonej stabilności. Poprawia zdrowie komórek.
Hepes	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał H4034	Chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych
Kwas L-askorbinowy	Laboratoria LKT	A7210	Stosowany w hodowlach komórkowych jako przeciwutleniacz
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Wspomaga przyczepianie się i wzrost komórek nerwowych in vitro
NEAA (Agencja Zdrowia)	Thermo Fisher Naukowy	11140035	Aminokwasy endogenne. Stosowany jako suplement do pożywki do hodowli komórkowych w celu zwiększenia wzrostu i żywotności komórek.
Zestaw Neon 100 μL	Thermo Fisher Naukowy	MPK10096	Zestaw do elektroporacji ogniw
System transfekcji neonów	Thermo Fisher Naukowy	MPK5000	System elektroporacji ogniw
Podłoże nerwowo-podstawowe	Thermo Fisher Naukowy	21103049	Pożywka podstawowa przeznaczona do długotrwałego utrzymania i dojrzewania populacji komórek neuronalnych bez konieczności stosowania warstwy zasilającej astrocyty
NutriStem-XF/FF	Przemysł biologiczny	05-100-1A	Pożywka hodowlana iPSC u ludzi
Pbs	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Bufor fosforanowy Dulbecco, z wapniem, z magnezem
Nie zawiera PBS Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Bufor fosforanowy Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu
Penicylina/Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Roztwór penicyliny/streptomycyny stosowany w celu zapobiegania zanieczyszczeniu kultur komórkowych przez bakterie.
poli-ornityna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4957	Wspomaga przyczepianie się i wzrost komórek nerwowych in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selektywny inhibitor receptora 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGFR-2)
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787	Glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy, t-oktylofenoksypolietylen, eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego. Stosowany do przenikania komórek w testach barwienia immunologicznego
Y-27632 (inhibitor ROCK)	Nauki przyrodnicze Enzo	ALX-270-333-M005	Przepuszczalny przez komórkę selektywny inhibitor kinazy białkowej zawierającej zwiniętą cewkę (ROCK) związaną z Rho. Zwiększa przeżywalność iPSC
μ-Slide 8 Studnia	Ibidi	Numer katalogowy: 80826	Obsługa wysokiej klasy analizy mikroskopowej komórek stałych