Generowanie modelu 3D kokultury ludzkich fibroblastów i neuronów rogówki

Streszczenie

Źródło: Sharif, R., et al. Inżynieria tkanki rogówki: Model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje technikę generowania trójwymiarowego systemu modeli wspólnej hodowli pierwotnych ludzkich fibroblastów rogówki i zróżnicowanych komórek neuronalnych. Ten system kohodowli może być wykorzystany do badania interakcji zrębu i nerwów.

Protokół

1. Pierwotne HCF (ludzkie fibroblasty rogówki) Hodowla i montaż konstruktów 3D

1. Aby złożyć konstrukty 3D z eksplantacji wcześniej uprawianych w EMEM, 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk, pasaż i liczenie HCF.
2. Wysiewaj około 1 x 10⁶ komórek / studzienkę pierwotnych HCF na wkładkach membrany poliwęglanowej z porami 0,4 μm z konstruktów 3D, wraz z 1,5 ml świeżego EMEM 10% FBS 1% antybiotyku/antybiotyku / antybiotyku na wierzch konstruktu. Dodaj kolejne 1,5 ml tej samej pożywki na dno każdej konstrukcji.
3. Po 24 godzinach wysiewu komórek hoduj komórki za pomocą EMEM 10% FBS 1% Antybiotyku/Antybiotyku, stymulowanego 0,5 mM kwasem 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowym (witamina C), dodając 1,5 ml na górze i 1,5 ml na dole każdego konstruktu.
4. Utrzymywać kultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5 % CO₂ przez 3 tygodnie i dostarczać świeże pożywki co drugi dzień przez cały okres badania. Nie jest potrzebne dalsze przejście.

2. Różnicowanie komórek i kokultury

1. Po 3 tygodniach dodaj 8 x 10³ komórki / studzienkę ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y na wierzchu wcześniej zmontowanych konstruktów 3D zawierających 1,5 ml EMEM zawierającego 10% FBS, 1% antybiotyku/antybiotyku i 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C).
   1. Pozwól komórkom nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y rosnąć na komórkach zrębu rogówki przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania komórek.
2. Zainicjuj różnicowanie komórek SH-SY5Y poprzez stymulację komórek EMEM zawierającym 1% FBS i 1,5 ml 10 μM kwasu retinowego na wierzchu konstruktu. Dodać 1,5 ml EMEM 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk Przeciwgrzybiczy 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C) na dno konstruktu. Należy pamiętać, że etap kwasu retinowego powinien być wykonywany w ciemności.
   1. Kontynuuj hodowlę komórek w tej pożywce różnicującej przez 5 dni.
3. Gdy komórki osiągną fazę różnicowania, należy przełączyć komórki na 1,5 ml pożywki wolnej od surowicy zawierającej 2 nM neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1% antybiotyku/antybiotyku dodanego do EMEM, dodając do górnej części konstruktu. Dodać 1,5 ml EMEM 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk Przeciwgrzybiczy 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C) na dno konstruktu. Należy pamiętać, że krok BDNF powinien być wykonywany w ciemności.
4. Hodować komórki przez dodatkowe 2 dni przed przetworzeniem w celu dalszej analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór buforowany fosforanem Dulbecco (1X)	Gibco firmy Life Technologies	Nr kat. 14190-144
Sterylne kleszcze	Fischer Naukowy	Numer katalogowy: 13-812-42	Fisherbrand preparuje ekstra cienkie kleszcze do odłamków
Żyletki z pojedynczą krawędzią	Personna	Numer katalogowy: 270100
Sterylne ostrza skalpela chirurgicznego nr 10	Ostrze chirurgiczne z piór	2976#10
Minimalne niezbędne podłoże Eagle	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2003
Surowica bydlęca płodu	Atlanta Biologicals	Zobacz materiał S11550	Do przygotowania mediów wymagane jest 10% FBS
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)	Gibco firmy Life Technologies	Numer katalogowy: 15240-062	Do przygotowania pożywki wymagane jest 1% antybiotyku-antybiotyku
0,05% trypsyna EDTA(1X)	Gibco firmy Life Technologies	25300062
Wkłady membranowe z poliwęglanu z porami 0,4 μm	Gwiazda Corning	3412
Kwas 2-O-α-Dglukopiranozylo-L-askorbinowy (witamina C)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Do badania należy użyć stężenia 0,5 mM
Komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y	Kontroler ATCC (Kontroler T	SHSY5YATCC CRL-2266
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	Należy zastosować końcowe stężenie 10uM
BDNF powiedział:	Sigma-Aldrich	Czynnik chłodniczy R2625-100MG	Należy zastosować końcowe stężenie 2nM
Sulcotlenek dimetylu (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	Ultra Pure Grade-Sterylne DMSO do użycia
Thermo Scientific EasYFlasks do hodowli komórek nunc (T25)	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-565-351
Thermo Scientific EasYFlasks poddane hodowli komórek nunc (T75)	Fisher Naukowy	12-565-349

SZT.