Zewnętrzne wzbudzenie jednowymiarowych wzorcowych kultur neuronalnych

Streszczenie

Źródło:Stern, S., et al. Zewnętrzne pobudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje technikę stymulowania kultur neuronalnych o liniowym wzorze za pomocą jednolitego, jednokierunkowego pola elektrycznego.

Protokół

1. Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności w kulturach neuronalnych za pomocą barwników fluorescencyjnych.

1. Przygotować roztwór 50 μg wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów/odczynników) w 50 μl DMSO (dimetylosulfotlenku).
2. Przygotować zewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy (EM) zawierający (w mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glukozę, 45 sacharozę (pH 7,4).
3. Inkubować hodowlę neuronów w 2 ml EM z 8 μl wrażliwego na wapń roztworu barwnika fluorescencyjnego przez 1 godzinę. Chronić przed światłem i delikatnie obracać, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie barwnika do komórek.
4. Zastąp roztwór świeżym EM przed obrazowaniem. Obrazowanie fluorescencyjne przedstawiono na rysunku 1.
5. Obraz w mikroskopie fluorescencyjnym z filtrami optycznymi do obrazowania fluorescencji wapnia (pik wzbudzenia przy 488 nm, pik emisji przy 520 nm), przy użyciu kamery i oprogramowania zdolnych do ilościowego określenia intensywności dowolnego obszaru zainteresowania (ROI) w polu widzenia mikroskopu.

2. Elektryczna stymulacja kultur

UWAGA: Podstawowa konfiguracja do stymulacji elektrycznej jest pokazana na rysunku 2. Szkiełko nakrywkowe, na którym hodowla neuronalna była hodowana przez około 14 dni, umieszcza się na szalce Petriego pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aktywność elektryczna neuronów jest obrazowana za pomocą barwników wrażliwych na wapń, podczas gdy napięcie jest podawane przez dwie pary elektrod do kąpieli, które są umieszczone na zewnątrz hodowli. Elektrody są napędzane przez generator sygnału, którego wyjście jest wzmacniane przez wzmacniacz dwukanałowy. Sterowanie napięciem w celu stymulacji jest preferowane w stosunku do bardziej standardowego sterowania prądem, ponieważ wektory pola elektrycznego są określane bezpośrednio, co umożliwia proste dodawanie i łączenie wektorów. Wymaga to dokładnego sprawdzenia jednorodności pola elektrycznego, które można przeprowadzić na całej próbce w przypadku kontroli napięcia. Podczas korzystania z kontroli napięcia należy zachować ostrożność, aby uniknąć pętli uziemienia i należy zweryfikować jednorodność pola elektrycznego.

1. Do stymulacji elektrycznej za pomocą jednorodnego pola elektrycznego należy użyć pary równoległych drutów elektrodowych.
   1. Należy stosować elektrody wykonane z platyny o grubości rzędu 0,005'' (127 μm). W przypadku stosowania ze szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 13 mm należy upewnić się, że odległość między dwiema elektrodami wynosi około 11 mm i umieścić elektrody 1 mm nad hodowlą.
      UWAGA: Do wykonania uchwytu elektrody (rysunki 3A) należy użyć politetrafluoroetylenu (PTFE). Wywierć wąskie otwory w PTFE, aby wprowadzić elektrody. Urządzenie powinno znajdować się wyżej niż roztwór zewnątrzkomórkowy, aby górny koniec, na którym odsłonięte są elektrody, nigdy nie stykał się z roztworem. Do izolacji użyj kleju epoksydowego na dowolnej części przewodów elektrod, która może być odsłonięta.
   2. Użyj kwadratowego kształtu impulsu z 50% cyklem pracy, bez składowej stałej, aby uniknąć elektrolizy. Zmieniaj czas trwania impulsu w zakresie od 10 μs do 4 ms, aby uzyskać skuteczną stymulację bez spalania kultury. Upewnij się, że amplituda jest rzędu ± 22 V (patrz rysunek 3). Impuls kwadratowy można zaobserwować na oscyloskopie podłączonym równolegle do elektrod.
      nuta: Aby łatwo zaprogramować dowolny pożądany przebieg, użyj komercyjnego oprogramowania do edycji przebiegów (patrz Lista materiałów). Wprowadź graficznie żądany przebieg i wyślij go do generatora przebiegów.
2. Aby sprawdzić jednorodność pola, użyj elektrody sondowej. Użyj siatki o wymiarach co najmniej 1 mm x 1 mm, aby umożliwić przesuwanie sondy w obszarze między elektrodami i pomiar potencjału elektrycznego.
   1. Zmierz potencjał elektryczny. Użyj do obliczenia pola elektrycznego. Użyj jednej z elektrod jako elektrody odniesienia. Zmierz pole elektryczne o zmiennym czasie trwania impulsu od 100 μs do 4 ms (patrz rysunek 3B dla przykładu czasu trwania impulsu 100 μs), aby sprawdzić, czy pole jest jednorodne w zakresie czasu trwania stymulacji.
      nuta: Na rysunku 3D przedstawiono przykład zmierzonej jednorodności pola elektrycznego, gdy czas trwania impulsu wynosił 1 ms.

Wyniki

Rysunek 1: Przykładowe ślady stanów przejściowych wapnia zobrazowane podczas synchronicznych wybuchów sieci. Obraz neuronów, które zostały zabarwione przed eksperymentem barwnikiem wapniowym. Ur. Ślady intensywności w funkcji czasu ROI w A z kolorem śladu reprezentującym kolor obramowania ROI w A. Duży wzrost intensywności zsynchronizowany w ramach trzech ROI oznacza pęknięcie sieci...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek wapnia, 1M	Przywra	Numer katalogowy: 21098	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
D-(+)-glukoza, 1M	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 65146	Pożywka galwaniczna, zewnątrzkomórkowy roztwór do nagrywania.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
KCl, 3M	Merck	1049361000	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
Chlorek magnezu, 1M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M1028	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
NaCl, 4M	Laboratorium biologiczne	19030591	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego .
Sacharoza, 1M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S1888	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
Druty elektrodowe	A-M Systems, Carlsborg WA	Numer telefonu 767000	Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych.
Generator sygnału	BKPrecision	Numer katalogowy: 4079	Kształtowanie sygnału elektrycznego.
wzmacniacz	domowej roboty		Wzmocnienie napięcia sygnału od generatora sygnału do elektrod.
zasilacz	matryca	Zobacz materiał MPS-3005 LK-3	Zasilanie maszyny do napylania.
Druty platynowe o grubości 0,005''; Systemy A-M,	Carlsborg WA	Numer telefonu 767000	Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych.

powiedział: