Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Streszczenie

Źródło: Ravi, B. et al., Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Protokół

1. Szczepy, pożywki hodowlane i montowanie zwierząt

1. Hoduj robaki C. elegans w temperaturze 20 °C na standardowych 60-milimetrowych płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsianych pokarmem bakteryjnym OP50 E. coli.
2. Przygotuj dwa plazmidy dla każdego interesującego promotora specyficznego dla komórki: jeden, napędzający ekspresję GCaMP5 do rejestrowania wewnątrzkomórkowego Ca²⁺, a drugi, napędzający ekspresję mCherry, aby umożliwić ratiometryczną kwantyfikację zmian fluorescencji GCaMP5 i uprościć znajdowanie i pomiar obiektów.
   nuta: Obrazowanie ratiometryczne GCaMP5:mCherry koryguje fluktuacje fluorescencji GCaMP5, które wynikają ze zmian ostrości i ruchu zwierząt, a nie rzeczywistych zmian w wewnątrzkomórkowym Ca²⁺.
3. Wstrzyknąć plazmidy wykazujące ekspresję GCaMP5 i mCherry wraz z widocznym plazmidem markera ratunkowego pL15EK do gonad zmutowanych zwierząt LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) X i odzyskać zwierzęta inne niż Muv lin-15 (+) eksprymujące GCaMP5 i mCherry z transgenu o wysokiej kopii. Użyj zmutowanego tła lite-1, aby zmniejszyć unikanie niebieskiego światła.
4. Integracja transgenów z chromosomami w celu zmniejszenia mozaickości i uproszczenia generowania złożonych zmutowanych szczepów.
   nuta: Opisany tutaj szczep LX2004 przenosi zintegrowany transgen o wysokiej kopii, który eksprymuje GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora nlp-3 (patrz tabela materiałów). Stwierdzono, że promotor nlp-3 napędza silną ekspresję w HSN późnego L4 i dorosłych zwierząt, nie powodując znaczących wad w rozwoju HSN lub zachowaniu związanym ze składaniem jaj w porównaniu z innymi testowanymi promotorami (np. TPH-1, EGL-6 i UNC-86). Ten szczep i inne, które wyrażają GCaMP5 i mCherry w neuronach ruchowych rdzenia brzusznego (VC), mięśniach sromu i komórkach neuroendokrynnych uv1 są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center, a szczegóły ich budowy zostały opisane.
5. Nałóż pokarm bakteryjny OP50 z płytki agarowej NGM z nasionami na dno kilofa do robaków platynowych i użyj go do przeniesienia ~ 20 późnych zwierząt L4 LX2004, które wykazują ekspresję GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora nlp-3. Upewnij się, że rozwijający się srom pojawia się w mikroskopie stereoskopowym jako wyraźna ciemna plama otoczona białym półksiężycem. Inkubować zwierzęta w temperaturze 20 °C przez 24–40 godzin.
6. Po inkubacji nałóż OP50 na zbiór i przenieś ~ 3 robaki na niezasianą płytkę NGM, pozostawiając niewielką ilość pokarmu, aby robaki mogły się nimi żywić podczas obrazowania. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo pokarmu, ponieważ zbyt mało pokarmu bakteryjnego zachęci robaki do oddalania się od środka talerza, podczas gdy zbyt dużo pokarmu zwiększy fluorescencję tła i spowoduje niedotlenienie.
7. Użyj płaskiej, zaokrąglonej szpatułki, aby odciąć kawałek o wymiarach ~ 20 mm x 20 mm z płytki zawierającej robaki i przenieś kawałek stroną zadrukowaną do dołu na środek czystego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 60 mm #1.5 (Rysunek 1). Rozpocznij aplikację z jednej strony, aby pęcherzyki nie zostały uwięzione pod szkiełkiem nakrywkowym i nie zakłócały obrazowania. Nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm #1 na wierzch kawałka, aby zmniejszyć przywieranie i parowanie.

2. Konfiguracja sprzętu i oprzyrządowania

1. Umieść inscenizowane, transgeniczne robaki na stoliku mikroskopu odwróconego z obiektywem planapochromatycznym o aperturze 20x ≥ 0,7, zmotoryzowanym stolikiem XY sterowanym za pomocą joysticka, rozdzielaczem obrazu i filtrami fluorescencyjnymi do jednoczesnego wzbudzenia i emisji GCaMP5 i mCherry, kamerami do obrazowania fluorescencyjnego i obrazowania w podczerwieni w jasnym polu oraz systemem oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) z możliwością wyzwalania (Rysunek 2A).
   UWAGA: Rozdzielacz wiązki 80/20 wysyła 80% sygnału obrazu do kamery fluorescencyjnej i 20% do kamery jasnego pola. Można również użyć mikroskopu pionowego, ale w tym przypadku fragment NGM powinien być umieszczony między szkiełkiem podstawowym a dużym szkiełkiem nakrywkowym.
   1. Użyj okularów lornetkowych, aby wybrać robaka do obrazowania. Po wybraniu zwierzęcia wsuń filtr podczerwieni na miejsce nad skraplaczem.
2. Wyzwalacze logiki tranzystor-tranzystor (TTL)
   1. Podłącz koncentryczne z każdej z trzech linii wyjściowych wyzwalacza TTL w kamerze fluorescencyjnej. Podłącz pierwsze wyjście do wejścia BNC #3 systemu oświetlenia LED.
   2. Podłącz drugie wyjście do adaptera BNC "bananowego" za pomocą zielonych i brązowych przewodów z 8-pinowego złącza GPIO biegnącego odpowiednio do wejścia GPIO #3 (pin 4) i masy (pin 5) kamery na podczerwień.
   3. Podłącz trzecie wyjście do adaptera BNC "bananowego" z przewodami połączeniowymi biegnącymi do wejścia cyfrowego #8 i uziemienia w cyfrowym urządzeniu akwizycyjnym (Rysunek 2B).
3. Cyfrowe urządzenie akwizycyjne (DAQ)
   1. Podłącz płytkę mikrokontrolera DAQ (patrz tabela materiałów) do komputera za pomocą USB. Zaktualizuj oprogramowanie układowe za pomocą standardowego protokołu Firmata (patrz tabela materiałów) i skonfiguruj port USB do komunikacji z prędkością 57600 bodów.
4. Diody led
   1. Uruchom oprogramowanie sterownika LED (patrz tabela materiałów). Przełącz tryb wyzwalania z "Ciągły" na "Bramkowany" i wybierz kanał wyzwalania "3" dla diod LED 470 i 590 nm.
   2. Włącz i wprowadź moc LED dla każdej diody LED (np. ustaw diodę LED 470 nm na 20%, a diodę LED 590 nm na 40%).
5. Uruchom skrypt komunikacji etapu szeregowego "XY-stage-final" w Bonsai (zobacz tabelę materiałów). Kliknij szary węzeł "CsvWriter" i wybierz folder, w którym chcesz zapisać nagrane informacje o etapach X i Y (Rysunek 3). Naciśnij zielony grot strzałki na pasku narzędzi, aby zainicjować DAQ.
   nuta: Skrypt rozpocznie nagrywanie pozycji stolika X i Y, gdy kamera fluorescencyjna wyśle sygnał TTL. Ten skrypt wyprowadza cztery kolumny danych: numer ramki, pozycję X (μm), pozycję Y (μm) i interwał między ramkami (s).
6. W oprogramowaniu do nagrywania kamery termowizyjnej (patrz Spis materiałów), w sekcji "Niestandardowe tryby wideo" wybierz "Tryb 1" (binning 2 x 2; 1,024 x 1,024 pikseli) i "Format pikseli Raw 8". W sekcji "Trigger / Strobe" ustaw linię wejściową wyzwalacza (GPIO) na "3", polaryzację na "High", a "Mode" na "14". Przełącz opcję "Włącz", aby zatrzymać akwizycję klatek do momentu odebrania sygnału wyzwalającego TTL.
   1. Pozostawiając to okno otwarte, kliknij czerwony przycisk "Nagraj" na głównym pasku narzędzi widoku kamery. Wybierz folder, w którym mają zostać zapisane sekwencje obrazów. Wybierz tryb nagrywania "Buforowany" i zapisz "Obrazy" w formacie JPEG. Kliknij "Rozpocznij nagrywanie", aby zainicjować przejęcie.
7. Kamera fluorescencyjna i rozdzielacz obrazu
   nuta: Kanały fluorescencyjne GCaMP5 i mCherry muszą być pobierane jednocześnie, aby zapewnić prawidłową rejestrację obrazu do ilościowego oznaczania ratiometrycznego. Rozdzielacz obrazu umożliwia dwukanałową akwizycję fluorescencji GCaMP5 i mCherry na jednym czujniku.
   1. W zakładce "Przechwytywanie" w oprogramowaniu do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów) ustaw czas ekspozycji na 10 ms, binning na 4x i głębię obrazu na 16 bitów. Wybierz wyśrodkowaną podtablicę kamery o szerokości 512 pikseli i wysokości 256 pikseli. Kliknij "Pokaż opcje wyzwalacza wyjściowego" i ustaw wszystkie wyzwalacze na "Pozytywne".
      UWAGA: DAQ może czasami przegapić wyzwalacze TTL, jeśli są one wygaszone 10 ms lub mniej.
   2. Upewnij się, że "Wyzwalacz 1" i "Wyzwalacz 2" są ustawione na "Ekspozycja", podczas gdy "Wyzwalacz 3" jest ustawiony na "Programowalny" z "Okresem" 25 ms. Na karcie "Sekwencja" wybierz "Upływ czasu" z "Opóźnieniem pola1" wynoszącym 50 ms, aby zbierać obrazy z częstotliwością 20 Hz. Wybierz opcję "Zapisz w tymczasowym buforze".
8. Wzmocnienie PMT i intensywność lasera podczas trójkanałowego obrazowania konfokalnego
   1. Ustaw wzmocnienie PMT tak, aby fluorescencja tła znajdowała się na poziomie nieco powyżej minimum (poziom czerni). Zwiększaj moc lasera 561 nm (zielonego) do momentu, gdy na końcu presynaptycznym w kanale mCherry zostanie zaobserwowany pojedynczy nasycony piksel 12-bitowy lub 16-bitowy.
   2. Dostosuj intensywność lasera 488 nm (niebieskiego) tak, aby fluorescencja GCaMP5 była widoczna tylko na końcu presynaptycznym nad tłem. To niskie ustawienie zapobiega nasyceniu pikseli GCaMP5, gdy fluorescencja wzrasta w odpowiedzi na silne stany nieustalone Ca²⁺. Otwórz otwór konfokalny do końca, aby zmaksymalizować przechwytywanie światła.

3. Ratiometryczne obrazowanie Ca²⁺ i rejestracja zachowania

1. W zakładce "Sekwencja" w oprogramowaniu do akwizycji fluorescencji kliknij "Start", aby rozpocząć nagrywanie. Śledź robaka za pomocą joysticka, utrzymując ostrość na interesujących komórkach i synapsach w centrum pola widzenia (FOV). Kliknij przycisk "Statystyki" w oknie histogramu, aby wyświetlić statystyki pikseli każdego kanału.
2. Dostosuj moc diody LED, aby zapewnić maksymalną jednopikselową fluorescencję mCherry na końcu presynaptycznym wynoszącą ≥ 8 000 zliczeń (~ 4 000 fotoelektronów), co daje ~ 12-bitowy zakres dynamiki nad tłem (~ 100 fotoelektronów). Sygnały GCaMP5 na końcu presynaptycznym podczas spoczynku (niskiego) Ca²⁺ powinny mieć około ~ 2,500 zliczeń - tylko widoczne nad tłem.
3. Nagrywaj do momentu osiągnięcia jednego stanu aktywnego składania jaj; zazwyczaj dzieje się to co 20-30 minut u robaka typu dzikiego. Zapisz 10-minutowy podzbiór (12 001 klatek), 6 000 klatek przed i po pierwszym zdarzeniu składania jaj (klatka 6 001). Upewnij się, że zachowałeś ten sam podzbiór obrazów w jasnym polu zachowania robaków i punktów czasowych pozycji stolika XY, w przeciwnym razie precyzyjna synchronizacja strumieni danych zostanie utracona.
4. Użyj ImageJ i wtyczki BioFormats (patrz Spis materiałów), aby przekonwertować sekwencje obrazów do formatu Image Cytometry Standard (.ics), aby można je było zaimportować do oprogramowania Ratiometric Quantitation.

Wyniki

Ryc. 1. Technika montażu C. elegans do obrazowania w wysokiej rozdzielczości aktywności i zachowania obwodu składania jaj.Góra, ostatnie mocowanie z boku. Na dole, końcowe mocowanie widziane przez spód dużego szkiełka nakrywkowego. Strzałki wskazują pokarm bakteryjny OP50, robaki C. elegans i jaja, umieszczone między kawałkiem agaru NGM a dużym szkiełkiem nakrywkow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wzrost, uprawa i montaż C. elegans
Szczep bakterii Escherichia coli, OP50	Centrum Genetyczne Caenorhabditis	Zobacz materiał OP50	Pokarm dla C. elegans. Uracyl auksotrof. E. coli B. Poziom bezpieczeństwa biologicznego 1
HSN GCaMP5+mOdmiana robaka wiśniowego	Centrum Genetyczne Caenorhabditis	LX2004	Zintegrowany transgen wykorzystujący promotor nlp-3 do napędzania ekspresji GCaMP5 i mCherry w HSN. Pełny genotyp: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
Lite-1(CE314), LIN-15(N765TS) zmutowany szczep do przygotowania transgenu	autor	LX1832	Szczep do odzyskiwania transgenów o wysokiej kopii po mikroiniekcji plazmidem ratunkowym pL15EK lin-15(n765ts). Posiada również powiązaną mutację lite-1 (ce314), która zmniejsza wrażliwość na światło niebieskie. Dostępne u autora na żądanie
pL15EK lin-15a/b genomowy plazmid ratunkowy	autor	pL15EK	Plazmid ratunkowy do odzyskiwania zwierząt transgenicznych po wstrzyknięciu do LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) X szczep. Dostępne u autora na żądanie
Plazmid pKMC299	autor	pKMC299	Plazmid do ekspresji mCherry w HSN z promotora nlp-3. Ma nieprzetłumaczony region nlp-3 3'
Plazmid pKMC300	autor	pKMC300	Plazmid do ekspresji GCaMP5 w HSN z promotora nlp-3. Ma nieprzetłumaczony region nlp-3 3'
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	Zobacz materiał P8281	Do przygotowania płyt NGM
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma	Zobacz materiał P5655	Do przygotowania płyt NGM
Siarczan magnezu siedmiowodny	Amresco (angielski)	662	Do przygotowania płyt NGM
Chlorek wapnia dwuwodny	Alfa Aesar	Numer katalogowy: 12312	Do przygotowania płyt NGM
Pepton	Becton Dickinson	Numer katalogowy: 211820	Do przygotowania płyt NGM
chlorek sodu	Amresco (angielski)	Rozdział 241	Do przygotowania płyt NGM
cholesterol	Alfa Aesar	Nr kat. A11470	Do przygotowania płyt NGM
Agar, bakteriologiczny typu A, ultraczysty	Affymetrix	Numer katalogowy: 10906	Do przygotowania płyt NGM
Szalki Petriego 60 mm	Firma VWR	25384-164	Do przygotowania płyt NGM
Okulary z mikro okularami 24 x 60 mm, #1.5	Firma VWR	Numer katalogowy: 48393-251	Szkło nakrywkowe, przez które obrazowane są robaki
Okulary z mikro okularami 22 x 22 mm, #1	Firma VWR	Numer telefonu 48366-067	Szkło nakrywkowe, które zakrywa górną część kawałka agaru
Mikroskop stereoskopowy z podstawą w świetle przechodzącym	Księga Leica	Zobacz materiał M50	Mikroskop preparacyjny do konserwacji, klasyfikacji i montażu szczepu ślimaka
Drut platynowo-irydowy, (80:20), 0.2mm	ALFA AESAR	AA39526-BW	Do przenoszenia ślimaków
Mikroskop do obrazowania wapnia
Stół powietrzny antywibracyjny	TMC (Międzynarodowa Organizacja T	63-544	Stół laboratoryjny Micro-g' Stół antywibracyjny 30" x 48" z 4" CleanTop M6 na górze 25mm
Odwrócony mikroskop złożony	Zeiss	Numer telefonu 431007-9902-000	Mikroskop odwrócony Axio Observer.Z1
Sideport L80/R100 (3-pozycyjny)	Zeiss	425165-0000-000	Aby przekierować 20% sygnału wyjściowego do kamery o jasnym polu (CMOS), 80% do kamery fluorescencyjnej (sCMOS)
Uchylny uchwyt podświetlenia	Zeiss	Numer telefonu 423920-0000-000	Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej
Obudowa lampy 12V/100W z kolektorem	Zeiss	Numer telefonu 423000-9901-000	Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej
Żarówka halogenowa 12V/100W	Zeiss	380059-1660-000	Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej. Diody LED ze światłem białym nie emitują znacznego światła podczerwonego, więc nie pozwolą na obrazowanie w jasnym polu po filtrze pasmowo-przepustowym podczerwieni
32 mm Filtr pasmowo-przepustowy podczerwieni (750-790 nm) do żarówki halogenowej	Zeiss	Numer telefonu 447958-9000-000	BP 750-790; DMR 32mm, do oświetlenia w podczerwieni dla jasnego pola i zachowania
6-filtrowa głowica rewolwerowa skraplacza (LD 0,55 H/DIC/Ph), zmotoryzowana	Zeiss	424244-0000-000	Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej
Kondensator i migawka	Zeiss	Numer telefonu 423921-0000-000	Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej
Lornetka z tubusem do kamery CMOS na podczerwień	Zeiss	Numer telefonu 425536-0000-000	Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej
Okular 10x, 23mm	Zeiss	Numer telefonu 444036-9000-000	Do lokalizacji robaków na kawałku agaru
Adapter C-Mount Demagnifier 2/3" 0,63x	Zeiss	426113-0000-000	Uchwyt do kamery CMOS na podczerwień
Kamera CMOS do jasnego pola podczerwieni i zachowania (czujnik 1")	FLIR (dawniej Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Kamera do obrazowania w jasnym polu
Karta kontrolera hosta USB 3.0	FLIR (dawniej Point Grey Research)	AC-01-1202	Fresco FL1100, 4 porty
8 pinów, GPIO o długości 1 m, okrągłe złącze Hirose HR25	FLIR (dawniej Point Grey Research)	AC-01-3000	Przewód do wyzwalania TTL. Zielony przewód łączy się z GPIO3 / Pin 4, a brązowy przewód łączy się z Ground / Pin 5
Planapochromat 20x/0,8 WD=0,55 M27	Zeiss	Numer telefonu 420650-9901-000	Najlepsza kombinacja powiększenia, przysłony numerycznej i odległości roboczej
6-sześcienna wieżyczka reflektorowa, zmotoryzowana	Zeiss	424947-0000-000	Do obrazowania fluorescencyjnego
Fluorescencyjny lekki pociąg, zmotoryzowany	Zeiss	423607-0000-000	Do obrazowania fluorescencyjnego
Migawka fluorescencyjna	Zeiss	Numer telefonu 423625-0000-000	Do obrazowania fluorescencyjnego
Kostka z podwójnym filtrem wzbudzenia i emisji GFP i mCherry (do mikroskopu)	Zeiss	Numer telefonu 489062-9901-000	Zestaw filtrów FL 62 HE BFP+GFP+HcRed do obrazowania fluorescencyjnego
System oświetlenia LED	Zeiss	Numer telefonu 423052-9501-000	Wyzwalany system LED Colibri.2 do oświetlenia fluorescencyjnego
Moduł LED GFP (470 nm)	Zeiss	Numer telefonu 423052-9052-000	Colibri.2 LED do wzbudzenia fluorescencji GFP
Moduł mCherry LED (590 nm)	Zeiss	Numer telefonu 423052-9082-000	Colibri.2 LED do wzbudzenia fluorescencji mCherry
Suwak zatrzymania przysłony do sprzętu ze światłem padającym	Zeiss	000000-1062-360	Przysłona polowa przysłony ograniczająca oświetlenie LED do pola widzenia kamery
Adapter C-Mount 1" 1.0x	Zeiss	426114-0000-000	Adapter do rozdzielacza obrazu i kamery fluorescencyjnej sCMOS
Rozdzielacz obrazu	Hamamatsu	A12801-01	Gemini W-View, można używać innych rozdzielaczy obrazu, ale mogą one nie być zoptymalizowane pod kątem dużego rozmiaru matrycy kamer sCMOS
Lustro dichroiczne GFP / mCherry (rozdzielacz obrazu)	Semrock	Di02-R594-25x36	Rozdzielanie GCaMP5 od mCherry i sygnałów podczerwieni
Filtr emisji GFP (rozdzielacz obrazu)	Semrock	Zobacz materiał FF01-525/30-25	Przechwytywanie fluorescencji GCaMP5
mCherry/ filtr emisyjny (rozdzielacz obrazu)	Semrock	FF01-647/57-25	Ten filtr jest niezbędny, aby wykluczyć światło podczerwone używane do obrazowania w jasnym polu
Kamera sCMOS do fluorescencji (czujnik 1")	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2. Nowsze modele pozwalają na osobne ustawienia akwizycji obrazu na osobnych połówkach matrycy, umożliwiając akwizycję obrazów dwukanałowych w połączeniu z rozdzielaczem obrazu
Zmotoryzowany stolik XY	Märzhäuser	SKANOWANIE IM 130 x 100	Ruch stolika; rozdzielczość XY tego stolika wynosi 0,2 μm na krok
Kontroler stolika XY z joystickiem	LUDL	MAC6000, joystick XY	Ręczne śledzenie robaków. MAC6000 kontroler należy podłączyć do komputera poprzez port szeregowy (RS-232) skonfigurowany na 115200 bodów
Cyfrowa tablica akwizycji (DAQ)	Arduino	ONZ	Odbieranie wyzwalaczy TTL z kamery sCMOS. Uno powinien być załadowany standardowym pakietem Firmata, a port USB komputera skonfigurowany na 57600 bodów
BNC męski na BNC męski — 6 stóp	Technologia Hosa	PŁYTA HOBB6	Złącza BNC do wyzwalania TTL
Pozłacany koncentryczny BNC męski na męski SMA (8,8")	uxcell (komórka uxcell)	6.08642E+11	Aby podłączyć wyjścia wyzwalające kamerę fluorescencyjną
Adapter głowicy obrotowej BNC	Hantek powiedział:	RRBNCTH21	Przejściówka BNC na wtyk bananowy (4mm)
Złącze BNC żeńskie na żeńskie	Diagnoza	20130530009	Przejściówka BNC żeńsko-żeńska do podłączenia wyjścia BNC z kamery do wtyku bananowego
Elastyczne przewody połączeniowe płytki stykowej bez	Z&T	GK1212827	Do podłączenia wyjść wyzwalających BNC do Arduiono DAQ. Męski na męski.
Stacja robocza o wysokiej wydajności	hp	Z820	Windows 7, 64 GB pamięci RAM, procesor Dual Xeon, dysk SSD C:, port szeregowy (RS-232), wiele gniazd PCIe3 do łączności Ethernet, karty USB 3.0 i dodatkowe dyski SSD
Dysk SSD M.2	Firma Samsung	MZ-V5P512BW	Szybkie przesyłanie strumieniowe i analiza danych obrazowych
Adapter dysku SSD M.2 do stacji roboczych	Lycom powiedział:	Czołg DT-120	Przejściówka z M.2 na PCIe 3.0 na 4 linie
Sieciowa pamięć masowa	Firma Synology	DS-2415+	Przechowywanie i analiza danych obrazowania
Dyski twarde	Zachodnia sieć cyfrowa	WD80EFZX	CZERWONY 8 TB, klasa 5400 obr./min, SATA 6 Gb/s, 128 MB pamięci podręcznej, 3,5 cala. Przechowywanie danych obrazowania (10 dysków + redundancja 2 dysków)
oprogramowanie
Akwizycja fluorescencji	Hamamatsu	HCImage DIA	Zapis dwukanałowych (GCaMP5 i mCherry) sekwencji obrazów fluorescencyjnych z prędkością 20 kl./s
Akwizycja Brightfield	FLIR (dawniej Point Grey Research)	Przechwytywanie muchy	Nagrywanie sekwencji obrazów JPEG w jasnym polu
Czytnik portów szeregowych stołu montażowego	bonsai	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Ułatwia śledzenie robaków podczas ich zachowania
Oprogramowanie sterownika LED	Zeiss	Test Micro Toolbox 2011	Aby ustawić intensywność i wejścia wyzwalające dla różnych diod LED w urządzeniu Colibri.2
ObrazJ	Nih	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Prosty przegląd sekwencji obrazów i zmian formatowania w celu importu do oprogramowania Ratiometric Quantitation
Programu excel	Firmy Microsoft	2002984-001-000001	Do generowania podzbiorów danych o wartościach oddzielonych przecinkami z objętości do analizy MATLAB
Znajdowanie szczytów	MATLAB (MATLAB)	Czynnik chłodniczy R2017a	Skrypt używany do obliczeń cech piku współczynnika
Kwantyfikacja ratiometryczna	Perkin Elmer	Objętość 6,3	Ułatwia obliczanie ratiometrycznych kanałów obrazu, segmentację obrazu w celu znalezienia obiektów i pomiar proporcji znalezionych obiektów
Skrypty
AnalyzeGCaMP_2017.m	MATLAB (MATLAB)	Średni stosunek i skrypt środka ciężkości XY	Analizuje dane wyjściowe ratiometryczne w formacie .csv, konsolidując obiekty i pozycje centroid, obliczając zmiany proporcji (ΔR/R), identyfikując piki i cechy pików oraz zapisując wykresy (z adnotacjami szczytowymi i bez) w formacie postscript. W przypadku importu pliku macierzy skrypt wyśle dane do trzech folderów: analizowane, szczytowe i ślady. "Przeanalizowane" dane wyjściowe są zbiorem macierzy skonsolidowanych obiektów z sześcioma kolumnami (jednostkami): czas (s), pole powierzchni (mikrony kwadratowe), stosunek, środek ciężkości X (mikrony), centroida Y (mikrony) i ΔR/R. Dane wyjściowe "Piki" są plikiem macierzy zawierającym punkty czasowe stwierdzonych pików, amplitudę (w ΔR/R), szerokość piku (s), i wyeksponowanie szczytu. Dane wyjściowe 'Ślady' są plikami postscriptowymi ze śladami wapnia.
Finał-etapu XY.bonsai	bonsai	Wyzwalany przez TTL DAQ i czytnik portów szeregowych pozycji stopnia	Rejestruje pozycję stopnia X i Y (w mikronach), gdy dołączone Arduino odbiera dodatni sygnał TTL z kamery sCMOS podczas naświetlania klatki. Skrypt zapisuje plik .csv z czterema kolumnami: numerem klatki, pozycją X (mikrony), pozycją Y (mikronami) i czasem, jaki upłynął między klatkami (zwykle ~50 ms przy nagrywaniu z prędkością 20 kl./s). Pozycje X i Y stolika z tego wyjścia (odpowiednio kolumny 2 i 3) są dodawane do pozycji środka ciężkości X i Y z AnalyzeGCaM