Badania skurczu i relaksacji tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drutowej

Podsumowanie

Opisana jest automatyczna metoda miografii do pomiaru siły w izolowanych tętnicach krezkowych. Wykorzystuje Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A do określenia odpowiedzi na fenylefrynę i zewnątrzkomórkowy wapń. Metoda pozwala na spójne wyznaczanie odpowiedzi izometrycznych na agonistów w małych naczyniach o średnicach 60 - 300 μm, niezależnie.

Streszczenie

Naczynia oporu proksymalnego, takie jak tętnice krezkowe, znacząco przyczyniają się do oporu obwodowego. Te małe naczynia o średnicy od 100 do 400 μm działają przede wszystkim w kierowaniu przepływu krwi do różnych narządów zgodnie z ogólnymi wymaganiami organizmu. Tętnica krezkowa szczura ma średnicę większą niż 100 μm. Technika miografii, po raz pierwszy opisana przez Mulvaya i Halperna¹, opierała się na metodzie zaproponowanej przez Bevana i^Oshera2. Technika ta dostarcza informacji o małych naczyniach w warunkach izometrycznych, w których zapobiega się znacznemu skróceniu preparatu mięśniowego. Ponieważ wytwarzanie siły i wrażliwość naczyń na różnych agonistów zależy od stopnia rozciągnięcia, zgodnie z aktywną zależnością naprężenie-długość, konieczne jest przeprowadzenie badań skurczu w warunkach izometrycznych, aby zapobiec podatności drutów montażowych. Druty ze stali nierdzewnej są preferowane zamiast drutów wolframowych ze względu na utlenianie tych ostatnich, co wpływa na nagrane odpowiedzi³. Technika ta pozwala na porównanie skurczów zamontowanych naczyń wywołanych przez agonistów w celu uzyskania dowodów na prawidłowe funkcjonowanie receptorów komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Wykazaliśmy w kilku badaniach, że izolowane tętnice krezkowe, które są zaciśnięte fenylyefryną, wiotczą się po dodaniu skumulowanych stężeń zewnątrzkomórkowego wapnia (^Ca2+_e). Odkrycia doprowadziły nas do wniosku, że okołonaczyniowe nerwy czuciowe, które wyrażają sprzężony z białkiem G receptor Ca^{2 +} (CaR), pośredniczą w tej odpowiedzi wazorelaksacyjnej. Za pomocą zautomatyzowanej metody miografii drutowej pokazujemy tutaj, że tętnice krezkowe szczurów Wistar, wrażliwych na sól Dahla (DS) i odpornych na sól Dahla (DR) reagują inaczej na Ca^{2 +} _e. Tkanki szczurów rasy Wistar wykazywały wyższą wrażliwość na Ca²⁺ w porównaniu z tkankami z DR i DS. Zmniejszona ekspresja CaR w tętnicach krezkowych u szczurów DS koreluje ze zmniejszoną relaksacją indukowaną przez Ca^{2 +} _e izolowanych, wstępnie skurczonych tętnic. Dane sugerują, że CaR jest wymagany do rozluźnienia tętnic krezkowych pod zwiększonym napięciem adrenergicznym, jak ma to miejsce w nadciśnieniu, i wskazują na nieodłączny defekt szlaku sygnałowego CaR u zwierząt Dahla, który jest znacznie poważniejszy w DS.

Metoda jest przydatna do określania reaktywności naczyń ex vivo w tętnicach krezkowych i podobnych małych naczyniach krwionośnych, a porównania między różnymi agonistami i/lub antagonistami mogą być łatwo i konsekwentnie oceniane obok siebie^6,7,8.

Protokół

1. Izolacja małej tętnicy krezkowej szczura

1. Znieczulić zwierzę izofluranem w zamkniętej komorze i przetrzeć brzuch alkoholem.
2. Wykonaj laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić łożysko krezkowe.
3. Za pomocą nożyczek usuń około 85 cm jelita z naczyniem pokarmowym z tętnicą krezkową górną. Przeciąć proksymalny koniec odcinka jelitowego w pobliżu odźwiernika i dystalny koniec w pobliżu połączenia krętniczo-ogonowego. Segmenty jelita są izolowane od szczurów, które są głęboko znieczulane izofluranem i poddawane eutanazji przez nakłucie serca na otwartej klatce piersiowej.
4. Wycięty wycinek umieszcza się na powlekanej szalce Petriego zawierającej PSS i przeprowadza się sekcję tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej.
5. Przypnij bliższy koniec jelita po prawej stronie i wytnij pozostałą część jelita w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (tj. bliższy koniec po lewej stronie naczynia pokarmowego po drugiej stronie jelita).
6. Wytnij segmenty gałęzi II i III razem z kawałkiem segmentu proksymalnego.
7. Wyciąć żyłę i odizolować tętnicę (z punktem rozgałęzienia w kształcie litery V) i oczyścić ją, usuwając tkankę tłuszczową i łączną. Unikaj bezpośredniego kontaktu z tętnicą, delikatnie ciągnąc kleszczami i przecinając błonę tkanki łącznej.

2. Montaż statku

1. Wytnij dwa krótkie segmenty (≈ 4 cm) drutu ze stali nierdzewnej o grubości 40 μm bez wolframu i za pomocą drobnych kleszczyków włóż po jednym do światła każdej tętnicy, uważając, aby nie uszkodzić śródbłonka. W razie potrzeby użyj końcówki drutu, aby otworzyć prześwit. Krew wypływająca z naczynia jest dobrym znakiem, że światło jest otwarte.
2. Napełnić komorę miografu roztworem soli fizjologicznej (PSS; mM: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO, 4,7H2 O, 5NaHCO₃, 1,2_K2HPO 4, 1,1 Na₂ HPO₄, 1,0 CaCl₂, 20 HEPES i 5 glukozy, pH 7,4) kwasem askorbinowym (100 μM) w temperaturze 37 °C i za pomocą kleszczy ostrożnie przenieść gwintowany segment naczynia z płytki Petriego do komory w temperaturze pokojowej i przenieść Wyciąć bliższy segment naczynia do komory miografu i pociągnąć koniec wzdłuż drutu, aby wprowadzić go do naczynia. Unikaj rozciągania naczynia.
3. Zamocuj bliski koniec drutu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara pod bliską śrubą mocującą na prawej szczęce podłączonej do mikrometru. Chwyć wolny koniec drutu kleszczami i zabezpiecz go zgodnie z ruchem wskazówek zegara pod dalszą śrubą mocującą na prawej szczęce. Upewnij się, że segment naczynia wzdłuż drutu znajduje się w szczelinie między szczękami, nie stykając się z samą szczęką.
4. Rozkręć szczęki i wyrównaj drugi drut równolegle do naczynia i włóż go do drugiego końca światła. Delikatnie przeprowadź drut przez prześwit segmentu naczynia jednym ruchem, używając już zamontowanego drutu jako prowadnicy. Trzymaj drut w odległości około 1 cm od naczynia, aby uniknąć rozciągania go podczas manewru i unikania dotykania śródbłonka.
5. Przykręć szczęki do siebie i upewnij się, że drugi przewód montażowy przesuwa się pod pierwszym zabezpieczonym na prawej szczęce.
6. Zamocuj bliski koniec drugiego przewodu w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara pod bliską śrubą mocującą lewej szczęki podłączonej do przetwornika.
7. Zamocuj drugi koniec drutu pod śrubą mocującą na lewej szczęce i dokręć, aby rozciągnąć drut.
8. Po zakończeniu montażu zresetuj silnik w "Menu montażu" i rozpocznij normalizację naczynia.

3. Normalizacja

Auto Dual Wire Myograph System- 510A posiada funkcję automatycznej normalizacji, która jest oceniana z menu "Normalizacja" i pozwala na rozciągnięcie naczynia do znormalizowanego obwodu wewnętrznego za pomocą standardowej procedury zgodnie z protokołem producenta po wyrównaniu przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Krzywa wykładnicza jest następnie dopasowywana do danych dotyczących ciśnienia na obwodzie wewnętrznym. Procedura określa średnicę światła (d100), którą tętnica miałaby in vivo, gdy jest rozluźniona i znajduje się pod ciśnieniem przezściennym 100 mmHg¹. Parametry normalizacji tętnicy krezkowej szczura są następujące:

1. Docelowe ciśnienie przezścienne = 13,3 kPa (100 mm Hg).
2. Czas = 60 sekund; Czas trwania każdego z kroków normalizacji.
3. IC₁/IC₁₀₀ = 0,9 (IC₁ = znormalizowany obwód wewnętrzny, IC₁₀₀ = obwód wewnętrzny odpowiadający ciśnieniu docelowemu.
4. Kalibracja okularu 2*Δ (mm/podział okularu); 2 delta służy do celów programistycznych.

Zmierz długość zamontowanej tętnicy krezkowej za pomocą odczytów okularu mikroskopu, gdy linie włosów znajdują się nad dalszymi i bliskimi końcami zamontowanego segmentu naczynia. Krótko mówiąc, długość zamontowanego segmentu naczynia jest mierzona przy maksymalnym powiększeniu za pomocą skalibrowanego okularu ocznego w mikroskopie preparacyjnym. Odczyt okularu z linią włosów nad drugim końcem segmentu (a₁) i bliskim końcem segmentu (a₂) w podziałach ocznych jest mierzony i rejestrowany. Wartości te, wraz z odczytami mikrometrów, przed i po rozciągnięciu naczynia są rejestrowane i wprowadzane do menu programu w celu obliczenia dopasowanej krzywej i średnicy wewnętrznej odpowiadającej docelowemu ciśnieniu poprzecznemu 100 mm Hg

W naszych badaniach, tętnice były ustawione na średnicę światła d₁ = 0,9 x d₁₀₀, gdzie aktywny rozwój siły jest maksymalny. Aktywny rozwój siły ≥ 10 mN w tętnicach krezkowych szczurów jest uważany za optymalny do przeprowadzenia eksperymentów. Tkanki o mniejszej sile czynnej zostały odrzucone.

4. Pomiar odpowiedzi

Po normalizacji, mechaniczne i funkcjonalne właściwości naczyń są reaktywowane poprzez wykonanie "standardowego startu", który polega na wymaganiu naczyń z wielokrotnym zastosowaniem (zwykle 2 lub 3) 5 μM fenylefryny (PE) w celu uzyskania powtarzalnych skurczów. Typowy "standardowy start" w naszym laboratorium składa się z serii okresów stymulacji i wymywania w następujący sposób:

1. Załóż pokrywę komory miografu i rozpocznij napowietrzanie 95% powietrzem i 5% CO_{2 .}
2. Napełnij komorę świeżym PSS (zawierającym 100 μM kwasu askorbinowego)
3. Naczynie kontraktowe z 5 μM PE przez 5 min i przemyć 4 razy buforem PSS.
4. Po ostatnim praniu napełnij komorę PSS i odczekaj 3 minuty przed powtórzeniem kroków (ii) i (iii).

Po standardowym starcie, tętnica jest gotowa do eksperymentu. Rozluźnienia zakontraktowanych naczyń ocenia się poprzez skumulowane dodawanie rosnących stężeń CaCl₂ (0,5 - 4 mM). W przypadku stosowania inhibitorów naczynia są wstępnie inkubowane ze związkami w komorze miografu przez 20 minut i obecne podczas testów.

5. Analiza danych

Dane "normalizacji" dla statków i śledzenia siły, bezpośrednio przekształcone w dane tekstowe, zostały przeanalizowane za pomocą programu graficznego SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Point Richmond, CA) i wykreślone tak, jak pokazano na rysunku 1. Dane stężenie-odpowiedź, obliczone na podstawie śledzeń, analizowano poprzez określenie wartości EC₅₀ na podstawie danych eksperymentalnych dopasowanych do czteroparametrowej funkcji logistycznej w menu Farmakologia programu. Porównania między grupami i wewnątrz grup przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a różnice z p < 0,05 uważa się za znaczące.

6. Reprezentatywne wyniki:

Parametry Wistar powiedział: Dahl wrażliwy na sól Dahl Odporny na sól L₁₀₀ (μm) 83,26 ± 2,33 91,52 ± 4,67 od 117,45 ± 8,43* X₁ 604,21 ± 41,97 752,24 ± 85,25 745,84 ± 110,09 R² 0,99 ± 0,003 0,97 ± 0,008 0,97 ± 0,007

*Różnica między wartościami L₁₀₀ dla Wistar i DR jest statystycznie istotna. Test normalności Shapiro-Wilka zdany (p = 0,588); Test równej wariancji zdany (p = 0,237).

L₁₀₀ = Wewnętrzna średnica zamontowanego segmentu odpowiadająca docelowemu ciśnieniu poprzecznemu.

X₁ = Ustawienie mikropozycjonera wymagane do rozciągnięcia zamontowanego naczynia do jego znormalizowanego obwodu wewnętrznego (tj. wartości odczytu mikrometru, przy którym przeprowadzono eksperymenty).

r² = Współczynnik regresji dla dopasowania (X_i, Y_i) do krzywej wykładniczej.

Uwaga: Szczegółowa procedura jest opisana w instrukcji dla 510A Myograph System⁶.

Tabela 1. Przykładowy odczyt parametrów normalizacji dla odcinków tętnicy krezkowej z Wistar, DS i DR z programu Basic pokazanego w "Menu normalizacji". Wartości są średnimi (± SEM) dla 5 zwierząt. *Różnice pomiędzy wartościami L₁₀₀ dla Wistar i DS są istotne statystycznie (p < 0,05).

Wistar powiedział: Ds Dr 14,2 ± 0,6 25,8 ± 2,7* 20,9 ± 1,3*

Tabela 2. Rozwinięte napięcia (mN) w tętnicach krezkowych izolowanych od szczurów Wistar, DS i DR, po zastosowaniu 5 μM PE do każdego naczynia. Podane wartości są średnimi (± SEM) dla 6-8 zwierząt. *Znacząco różni się od kontroli Wistar (p < 0,05).

Rysunek 1. Wywołane przez Ca^{2 +} _e rozluźnienie tętnicy krezkowej skurczonej przez PE u szczura Wistar zamontowanego w drucianym miografie w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca²⁺. Tętnicę równoważono przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy stałym napowietrzaniu i określeniu odpowiedzi na Ca^{2 +} _e. Pokazano reprezentatywne śledzenie siły po dodaniu 5 μM PE, po którym następuje skumulowane dodawanie Ca²⁺.

Rysunek 2. Wywołane przez Ca^{2 +} _e rozluźnienie tętnicy krezkowej skurczonej PE od szczura DS zamontowanego w miografie drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca²⁺. Tętnicę równoważono przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy stałym napowietrzaniu i określeniu odpowiedzi na Ca^{2 +} _e. Pokazano reprezentatywne śledzenie siły po dodaniu 5 μM PE, po którym następuje skumulowane dodawanie Ca²⁺. Relaksacja Ca²⁺ była poważnie zagrożona w tej tkance w porównaniu z tymi u szczurów Wistar i DR.

Rysunek 3. Wywołane przez Ca^{2 +} _e rozluźnienie tętnicy krezkowej skurczonej PE od szczura DR zamontowanego w miografie drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca²⁺. Tętnicę równoważono przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy stałym napowietrzaniu i określeniu odpowiedzi na Ca^{2 +} _e. Pokazano reprezentatywne śledzenie siły po dodaniu 5 μM PE, po którym następuje skumulowane dodawanie Ca²⁺.

Rysunek 4. A. [Ca²⁺]Krzywe _{odpowiedzi elektronicznej}. Ur. Wykres słupkowy przedstawiający wartości EC₅₀ dla relaksacji wyznaczone przez dopasowanie danych do czteroparametrowej krzywej logistycznej. C. Ekspresja CaR w arkadach krezkowych odizolowanych od szczurów DR i DS.

Dyskusja

Nadciśnienie tętnicze jest główną przyczyną zachorowalności/śmiertelności sercowo-naczyniowej, mózgowej i nerkowej. Występowanie nadciśnienia tętniczego jest wysokie w populacji, a nadciśnienie wrażliwe na sól jest szczególnie wysokie w starzejącej się populacji i występuje częściej u osób czarnoskórych niż białych. Uważa się, że jest to spowodowane tendencją czarnych do zatrzymywania sodu w nerkach⁹. Wrażliwość na sól jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do chorób nerek i jest związana z dysfunkcją śró...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Automatyczny dwuprzewodowy system miograficzny-510ADMT-USA, Inc.	Atlanta, Georgia.	100151
System Akwizycji Danych PowerLab/4SP	ADInstruments	ML750Dostępne	są nowe modele z 4-16 kanałami wejściowymi.
Komputer Dell Dimension XPS Gen 4 Mikroskop
Stemi SV II (Apo) z okularem	Carl Zeiss, Inc.
Wistar, szczury wrażliwe na sól Dahla, szczury odporne na sól Dahla	Harlan Laboratories
Gryzonie karma	Harlan Laboratories
Fenylefryna	Sigma-Aldrich
Inne chemikalia			Wszystkie użyte chemikalia były najczystszych gatunków dostępnych na rynku.