Badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

Podsumowanie

Opisano zautomatyzowaną metodę miografii do pomiarów siły w izolowanych tętnicach krezkowych. Wykorzystuje ona urządzenie Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A do określania reakcji na fenylefrynę oraz wapń zewnątrzkomórkowy. Metoda ta pozwala na spójne określanie odpowiedzi izometrycznych na agonistów w małych naczyniach o średnicach od 60 do 300 μm, niezależnie od siebie.

Streszczenie

Proksymalne naczynia oporowe, takie jak tętnice krezkowe, w znacznym stopniu przyczyniają się do oporu obwodowego. Te małe naczynia o średnicy od 100-400 μm pełnią przede wszystkim funkcję kierowania przepływu krwi do poszczególnych narządów, zgodnie z ogólnymi zapotrzebowaniami organizmu. Tętnica krezkowa szczura ma średnicę większą niż 100 μm. Technika miografii, po raz pierwszy opisana przez Mulvaya i Halperna¹, opierała się na metodzie zaproponowanej przez Bevana i Oshera². Technika ta dostarcza informacji o małych naczyniach w warunkach izometrycznych, w których zapobiega się znacznemu skróceniu preparatu mięśniowego. Ponieważ generowanie siły oraz wrażliwość naczyń na różne agoniści zależą od stopnia rozciągnięcia, zgodnie z zależnością między aktywnym napięciem a długością, kluczowe jest przeprowadzanie badań skurczu w warunkach izometrycznych, aby zapobiec podatności drutów mocujących. Drutom ze stali nierdzewnej preferuje się nad drutami wolframowymi ze względu na utlenianie się tych drugich, co wpływa na rejestrowane odpowiedzi³. Technika ta pozwala na porównanie skurczów naczyń wywołanych agonistami w celu uzyskania dowodów na prawidłowe funkcjonowanie receptorów komórek mięśni gładkich naczyń.

W kilku badaniach wykazaliśmy, że izolowane tętnice krezkowe skurczone fenylefryną rozkurczają się po dodaniu kumulatywnych stężeń pozakomórkowego wapnia (Ca²⁺_e). Wyniki te doprowadziły nas do wniosku, że reakcję wazorelaksacji tę tę pośredniczą okołonaczyniowe nerwy sensoryczne, które wykazują ekspresję sprzężonego z białkiem G receptora wyczuwającego Ca²⁺ (CaR). Wykorzystując zautomatyzowaną metodę miografii drucianej, wykazujemy tutaj, że tętnice krezkowe szczurów Wistar, Dahl wrażliwych na sól (DS) oraz Dahl odpornych na sól (DR) reagują odmiennie na Ca²⁺_e. Tkanki szczurów Wistar wykazały wyższą wrażliwość na Ca²⁺ w porównaniu do tkanek szczurów DR i DS. Obniżona ekspresja CaR w tętnicach krezkowych szczurów DS koreluje ze zredukowanym rozkurczaniem izolowanych, uprzednio skurczonych tętnic indukowanym przez Ca²⁺_e. Dane sugerują, że CaR jest niezbędny do rozkurczania tętnic krezkowych przy zwiększonym napięciu adrenergicznym, jak ma to miejsce w nadciśnieniu, oraz wskazują na wrodzony defekt w ścieżce sygnalizacyjnej CaR u zwierząt linii Dahl, który jest znacznie silniejszy u szczurów DS.

Metoda ta jest użyteczna w określaniu reaktywności naczyniowej ex vivo w oporowych tętnicach krezkowych i podobnych małych naczyniach krwionośnych, a porównania między różnymi agonistami i/lub antagonistami mogą być łatwo i spójnie oceniane obok siebie^6,7,8.

Protokół

1. Izolacja tętnicy krezkowej szczura

1. Zanurzyć zwierzę w narkozie z użyciem izofluranu w zamkniętej komorze, a następnie przemyć brzuch alkoholem.
2. Wykonać laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić kłoikę krezkową.
3. Za pomocą nożyczek wyciąć około 85 cm jelita wraz z naczyniami doprowadzającymi z tętnicy krezkowej górnej. Odciąć koniec proksymalny odcinka jelita blisko odźwiernika oraz koniec dystalny w pobliżu połączenia kątniczego. Segmenty jelita izoluje się od szczurów pod głęboką narkozą izofluranową, które zostały poddane eutanazji poprzez punkcję serca przy otwartej klatce piersiowej.
4. Umieścić wycięty odcinek w powlekonej szalce Petrigo zawierającej PSS i przeprowadzić dyssekcję tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej.
5. Przymocować koniec proksymalny jelita po prawej stronie, a pozostałą część jelita przypiąć w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (tj. koniec proksymalny po lewej stronie, naczynia doprowadzające po przeciwnej stronie jelita).
6. Wypreparować segmenty gałęzi II i III wraz z fragmentem segmentu proksymalnego.
7. Wypreparować żyłę i wyizolować tętnicę (z V-kształtnym punktem rozgałęzienia), a następnie oczyścić ją poprzez usunięcie tkanki tłuszczowej i łącznej. Unikać bezpośredniego kontaktu z tętnicą, delikatnie odciągając ją pęsetą i przecinając błonę tkanki łącznej.

2. Montaż naczynia

1. Odciąć dwa krótkie odcinki (≈ 4 cm) drutu ze stali nierdzewnej bez zawartości wolframu o średnicy 40 μm i za pomocą precyzyjnej pęsety wprowadzić jeden z nich do światła każdej z tętnic, uważając, aby nie uszkodzić śródbłonka. W razie potrzeby użyć końcówki drutu do udrożnienia światła. Wypływająca z naczynia krew jest dobrym sygnałem, że światło zostało otwarte.
2. Napełnić komorę miografu fizjologicznym roztworem soli (PSS; mM: 15 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO₄.7H₂O, 5 NaHCO₃, 1,2 K₂HPO₄, 1,1 Na₂HPO₄, 1,0 CaCl₂, 20 HEPES oraz 5 glukozy, pH 7,4) z dodatkiem kwasu askorbinowego (10 μM) w temperaturze 37 °C; następnie za pomocą pęsety ostrożnie przenieść nawleczony segment naczynia z szalki Petriego do komory w temperaturze pokojowej, przenieść wycięty proksymalny odcinek naczynia do komory miografu i przeciągnąć koniec wzdłuż drutu, aby wprowadzić go do naczynia. Unikać rozciągania naczynia.
3. Zabezpieczyć bliski koniec drutu, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, pod bliską śrubą mocującą w prawym zacisku połączonym z mikrometrem. Chwycić wolny koniec drutu pęsetą i zabezpieczyć go, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pod daleką śrubą mocującą w prawym zacisku. Upewnić się, że segment naczynia znajdujący się wzdłuż drutu jest umieszczony w szczelinie między zaciskami, nie mając kontaktu z samym zaciskiem.
4. Rozsunąć zaciski za pomocą śrub, ustawić drugi drut równolegle do naczynia i wprowadzić go do dalszego końca światła. Delikatnie przesunąć drut przez światło segmentu naczynia jednym ruchem, używając już zamontowanego drutu jako prowadnicy. Trzymać drut około 1 cm od naczynia, aby uniknąć jego rozciągnięcia podczas tego manewru, i unikać dotykania śródbłonka.
5. Zsunąć zaciski i upewnić się, że drugi drut montażowy przesuwa się pod pierwszym, zabezpieczonym w prawym zacisku.
6. Zabezpieczyć bliski koniec drugiego drutu, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pod bliską śrubą mocującą w lewym zacisku połączonym z przetwornikiem.
7. Zabezpieczyć daleki koniec drutu pod śrubą mocującą w lewym zacisku i dokręcić, aby naciągnąć drut.
8. Po zakończeniu montażu zresetować silnik w „Menu Montażu” (Mounting Menu) i rozpocząć normalizację naczynia.

3. Normalizacja

System Auto Dual Wire Myograph- 510A posiada zautomatyzowaną funkcję normalizacji, która jest uruchamiana z menu „Normalization” i pozwala na rozciągnięcie naczynia do znormalizowanego obwodu wewnętrznego zgodnie ze standardową procedurą według protokołu producenta po 30 min równoważenia w temperaturze 37 °C. Następnie do danych dotyczących ciśnienia i obwodu wewnętrznego dopasowywana jest krzywa wykładnicza. Procedura ta określa średnicę światła (d10), którą tętnica posiadałaby in vivo w stanie rozluźnienia i pod wpływem ciśnienia transmuralnego wynoszącego 10 mmHg¹. Parametry normalizacji dla tętnicy krezkowej szczura są następujące:

1. Docelowe ciśnienie transmuralne = 13.3 kPa (10 mm Hg).
2. Czas = 60 sec; Czas trwania każdego z etapów normalizacji.
3. IC₁/IC₁₀ = 0.9 (IC₁ = znormalizowany obwód wewnętrzny, IC₁₀ = obwód wewnętrzny odpowiadający ciśnieniu docelowemu).
4. Kalibracja okularu 2*Δ (mm/podziałka okularowa); 2 delta jest wprowadzone ze względów programistycznych.

Zmierz długość zamocowanej tętnicy krezowej, odczytując wartości z okularu mikroskopu w momencie, gdy linie celownicze znajdują się nad dalszym i bliższym końcem zamocowanego segmentu naczynia. W skrócie, długość zamocowanego segmentu naczynia mierzy się przy maksymalnym powiększeniu za pomocą skalowanego okularu w mikroskopie dissectingowym. Odczyty z okularu z linią celowniczą nad dalszym końcem segmentu (a₁) oraz nad bliższym końcem segmentu (a₂), podane w podziałkach okularych, należy zmierzyć i zapisać. Wartości te, wraz z odczytami z mikrometru przed i po rozciągnięciu naczynia, są zapisywane i wprowadzane do menu programu w celu obliczenia dopasowanej krzywej oraz średnicy wewnętrznej odpowiadającej docelowemu ciśnieniu transmuralnemu 10 mm Hg

W naszych badaniach tętnice ustawiono na średnicę światła d₁ = 0,9 x d₁₀, przy której generowanie siły aktywnej jest maksymalne. Uznaje się, że generowanie siły aktywnej na poziomie ≥ 10 mN w tętnicach krezkowych szczura jest optymalne do kontynuowania eksperymentów. Tkanki wykazujące niższą siłę aktywną zostały odrzucone.

4. Pomiar odpowiedzi

Po normalizacji właściwości mechaniczne i funkcjonalne naczyń są ponownie aktywowane poprzez wykonanie „standardowego startu”, który polega na poddaniu naczyń wielokrotnym aplikacjom (zazwyczaj 2 lub 3) 5 μM fenylefryny (PE) w celu uzyskania powtarzalnych skurczów. Typowy „standardowy start” w naszym laboratorium składa się z serii stymulacji i okresów wypłukiwania w następujący sposób:

1. Założyć pokrywę komory miografu i rozpocząć napowietrzanie mieszanką 95% powietrza i 5% CO₂.
2. Wypełnić komorę świeżym roztworem PSS (zawierającym 10 μM kwasu askorbinowego).
3. Wywołać skurcz naczynia za pomocą 5 μM PE przez 5 min, a następnie przemyć 4 razy buforem PSS.
4. Po ostatnim przemyciu ponownie wypełnić komorę roztworem PSS i odczekać 3 min przed powtórzeniem kroków (ii) i (iii).

Po standardowej procedurze przygotowania tętnica jest gotowa do eksperymentu. Rozkurcze skurczonych naczyń ocenia się poprzez kumulatywne dodawanie zwiększających się stężeń CaCl₂ (0.5 - 4 mM). W przypadku zastosowania inhibitorów naczynia są wstępnie inkubowane z tymi związkami w komorze miografu przez 20 min i pozostają one obecne podczas przeprowadzania testów.

5. Analiza danych

Dane „Normalizacji” dla naczyń oraz zapisy siły, bezpośrednio przekonwertowane na dane tekstowe, zostały przeanalizowane za pomocą programu graficznego SigmaPlot 1.0 (Systat Software, Point Richmond, CA) i przedstawione na wykresach, jak pokazano na Rysunku 1. Dane zależności stężenie-odpowiedź, obliczone na podstawie zapisów, przeanalizowano poprzez wyznaczenie wartości EC₅₀ z danych eksperymentalnych dopasowanych do czteroparametrowej funkcji logistycznej w menu Pharmacology programu. Porównania między grupami oraz wewnątrz grup przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a różnice przy p < 0,05 uznano za istotne.

6. Reprezentatywne wyniki:

Parametry	Wistar	Dahl wrażliwe na sól	Dahl odporne na sól
L10 (μm)	83.26 ± 2.3	91.52 ± 4.67	17.45 ± 8.43*
X1	604.21 ± 41.97	752.24 ± 85.25	745.84 ± 110.09
r2	0.9 ± 0.03	0.97 ± 0.08	0.97 ± 0.07

*Różnica między wartościami L₁₀ dla szczurów rasy Wistar i DR jest istotna statystycznie. Test normalności Shapiro-Wilka przebiegł pomyślnie (p = 0,58); test równości wariancji przebiegł pomyślnie (p = 0,237).

L₁₀ = średnica wewnętrzna zamocowanego segmentu odpowiadająca docelowemu ciśnieniu transmuralnemu.

X₁ = Ustawienie mikro-pozycjonera wymagane do rozciągnięcia zamontowanego naczynia do jego znormalizowanego obwodu wewnętrznego (tj. wartość odczytu mikrometru, przy której przeprowadzono eksperymenty).

r² = współczynnik regresji dla dopasowania (X_i, Y_i) do krzywej wykładniczej.

Uwaga: Szczegółowa procedura jest opisana w instrukcji obsługi systemu miografu 510A⁶.

Tabela 1. Przykładowy odczyt parametrów normalizacji dla odcinków tętnicy krezkowej u szczurów Wistar, DS i DR z programu podstawowego, przedstawiony w „Menu Normalizacji”. Wartości są średnimi (± SEM) z 5 zwierząt. *Różnice między wartościami L₁₀ dla grup Wistar i DS są istotne statystycznie (p < 0,05).

Wistar	DS	DR
14.2 ± 0.6	25.8 ± 2.7*	20.9 ± 1.3*

Tabela 2. Wygenerowane napięcia (mN) w tętnicach krezkowych wyizolowanych od szczurów Wistar, DS i DR po zastosowaniu 5 μM PE do każdego naczynia. Przedstawione wartości są średnimi (± SEM) z 6-8 zwierząt. *Różnica istotna statystycznie w porównaniu z kontrolą Wistar (p < 0.05).

Rycina 1. Ca²⁺_eindukowana rozkurcz depresji tętnicy krezkowej szczura Wistar, skurczonej fenylefryną (PE) i zamocowanej w myografu drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca²⁺Tętnicę równoważono przez 30 min w 37 °C przy stałym napowietrzaniu i odpowiedziach na Ca²⁺_e wyznaczono. Reprezentatywny przebieg siły po dodaniu 5 μM PE, a następnie kumulatywne dodatki Ca²⁺ jest przedstawiony.

Rysunek 2. Ca²⁺_erozluźnienie wywołane przez [substancja] tętnicy krezkowej szczura DS skurczonej PE, zamocowanej w myografie drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca²⁺Tętnicę równoważono przez 30 min w 37 °C przy stałym napowietrzaniu i odpowiedziach na Ca²⁺_e wyznaczono. Reprezentatywny zapis siły po dodaniu 5 μM PE, a następnie kumulatywne dodatki Ca²⁺ jest przedstawiony. Ca²⁺ zdolność do rozkurczu była w tej tkance znacznie upośledzona w porównaniu z tkankami pobranymi od szczurów linii Wistar i DR.

Rysunek 3. Ca²⁺_e-wywołany rozkurcz skurczonej PE tętnicy krezkowej szczura DR, zamocowanej w myografie drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca²⁺Tętnicę równoważono przez 30 min w 37 °C przy stałym napowietrzaniu i odpowiedziach na Ca²⁺_e wyznaczono. Reprezentatywny zapis siły po dodaniu 5 μM PE, a następnie kumulatywne dodatki Ca²⁺ zostało przedstawione.

Rysunek 4. A. [Ca²⁺]_e-krzywe odpowiedzi. B. Wykres słupkowy przedstawiający EC₅₀ wartości relaksacji wyznaczone poprzez dopasowanie danych do czteroparametrycznej krzywej logistycznej. C. Ekspresja CaR w splotach krezkowych wyizolowanych od szczurów DR i DS.

Dyskusja

Nadciśnienie tętnicze jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności z powodu schorzeń sercowo-naczyniowych, mózgowych oraz nerek. Częstość występowania nadciśnienia w populacji jest wysoka, a nadciśnienie soloodporne występuje szczególnie często u osób starszych oraz częściej u osób rasy czarnej niż białej. Uważa się, że wynika to z tendencji osób rasy czarnej do zatrzymywania sodu w nerkach⁹. Nadwrażliwość solna jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do chorób nerek i wiąże się z dysfunkcją śródb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc.	Atlanta, GA.	10151
System akwizycji danych PowerLab/4SP	ADInstruments	ML750	Dostępne są nowe modele z 4-16 kanałami wejściowymi.
Komputer Dell Dimension XPS Gen 4	Dell
Mikroskop do sekcji Stemi SV II (Apo) z okularem	Carl Zeiss, Inc.
Szczury Wistar, Dahl wrażliwe na sól, Dahl odporne na sól	Harlan Laboratories
Karma dla gryzoni	Harlan Laboratories
Fenylefryna	Sigma-Aldrich
Inne odczynniki chemiczne			Wszystkie użyte odczynniki chemiczne były o najwyższej dostępnej czystości komercyjnej.