Rejestrowanie oscylacji pasma gamma z neuronów jądra szypułkowego w wycinku mózgu

Streszczenie

Źródło: Urbano, F. J., et al. Rejestrowanie oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego. J. Vis. Exp. (2016).

Film demonstruje metodę rejestrowania oscylacji pasma gamma w neuronach PPN. Wykorzystując strzałkowy odcinek mózgu z blokerami synaptycznymi w aCSF, wykorzystuje dodatnie impulsy prądu za pośrednictwem pipety do otwierania kanałów wapniowych, indukując aktywność podprogową niezbędną do czuwania.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)

1. Przygotowanie roztworu podstawowego A
   1. Dodać 700 ml wody destylowanej do czystej zlewki o pojemności 1 l przed dodaniem chemikaliów.
   2. Ciągle mieszając objętość 500 ml, dodać 136,75 g NaCl, 6,99 g KCl, 2,89 g_MgSO4 i 2,83 g NaH₂PO₄.
   3. Dodaj więcej wody destylowanej, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mM_MgSO4 i 1,18 mM NaH₂PO₄.
   4. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
2. Przygotowanie roztworu podstawowego B
   1. Dodaj 700 ml wody destylowanej do czystej zlewki o pojemności 1 l przed dodaniem chemikaliów.
   2. Ciągle mieszając objętość 500 ml, dodać 41,45 g D-glukozy i 41,84 g NaHCO₃.
   3. Dodaj więcej wody destylowanej, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 11,5 mM D-glukozy i 24,9 mM_NaHCO3.
   4. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
   5. Przed każdym doświadczeniem zmieszać 50 ml bulionu A z 50 ml bulionu B i doprowadzić do 1 l wodą destylowaną w celu uzyskania końcowego stężenia roztworu CSF i pozostawić w temperaturze pokojowej, ciągle natleniając go karbogenem (95%_O2 - 5% mieszaniny CO_{2 )} przez co najmniej 30 minut. Przygotować końcowe stężenie aCSF tylko na początku każdego doświadczenia i wyrzucić na koniec dnia.

2. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego z sacharozą (sacharoza-aCSF)

1. Przygotowanie roztworu podstawowego C
   1. Dodać 700 ml wody destylowanej do czystej zlewki o pojemności 1 l przed dodaniem chemikaliów.
   2. Ciągle mieszając 500 ml wody destylowanej, dodać 240 g sacharozy, 6,55 g NaHCO₃, 0,671 g KCl, 4,88 g MgCl₂, 0,22 g CaCl₂ i 0,21 g kwasu askorbinowego.
   3. Dodaj więcej wody destylowanej, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 701,1 mM sacharozy, 78 mM NaHCO₃, 9 mM KCl, 24 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂ i 1,2 mM kwasu askorbinowego.
   4. Roztwór podstawowy C przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
   5. Przed każdym doświadczeniem zmieszać 300 ml 50 ml bulionu C z 600 ml wody destylowanej, aby otrzymać roztwór sacharozy-aCSF o końcowym stężeniu. Pozostawić w temperaturze pokojowej, ciągle natleniając go karbogenem (mieszanka 95%_O2 - 5%_CO2) przez co najmniej 30 minut.

3. Przygotowanie plastra

1. Umieścić czystą zlewkę ze 100 ml roztworu sacharozy-aCSF w lodzie, natleniając go karbogenem i ustalić pH na 7,4 za pomocą pH-metru, dodając kilka kropli 0,1 M roztworu NaOH (gdy pH < 7,4) lub 0,1 M roztworu HCl (gdy pH > 7,4).
2. Napełnij komorę tnącą wibratomu sacharozą-aCSF i natlenić ją. Włączyć układ chłodniczy na bazie glicerolu sprzężony z komorą tnącą i odczekać 15 minut, aby ostygł do 0 - 4 °C.
3. Znieczulenie szczeniąt szczurów (w wieku od 9 do 12 lat od dorosłych szczurów Sprague-Dawley w ciąży w czasie) ketaminą (70 mg/kg, i.p.; przy użyciu < 50 μl końcowej objętości). Kiedy szczenię jest spokojne, sprawdź dwukrotnie, czy nie ma odruchu szczypania ogona.
4. Ścięte szczenięta.
   1. Przetnij skórę głowy wzdłużnie od przodu do tyłu za pomocą ostrza skalpela ze stali węglowej i pociągnij skórę na boki za pomocą kleszczy. Przetnij kość pokrywającą mózg, przesuń nożyczki na boki i całkowicie ją usuń, aby odsłonić mózg.
   2. Następnie szybko usuń mózg za pomocą szpatułki (początkowo umieszczonej pod opuszką węchową, aby delikatnie wypchnąć ją z najbardziej rostralnych w kierunku najbardziej ogonowych). Delikatnie wepchnij mózg do chłodzonego lodem, natlenionego sacharozy i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (sacharoza-aCSF).
5. Wykonaj cięcie przystrzałkowe na prawej półkuli (usuwając około jednej trzeciej półkuli) i przyklej przyciętą stronę mózgu do metalowego dysku, który zostanie magnetycznie przymocowany do komory tnącej wibrokrajalnicy, aby wyciąć strzałkowe odcinki 400 μm zawierające jądro szypułkowe (PPN). Trzymaj plasterki PPN w temperaturze RT przez 45 minut przed nagraniami patch-clamp całej komórki.

4. Zapisy oscylacji pasma gamma w warstwach PPN

1. Przygotowanie wewnątrzkomórkowego roztworu glukonianu potasu (roztwór o wysokiej zawartości K+)
   1. Umieścić w lodzie czystą zlewkę z 10 ml wody destylowanej. Ciągle mieszając dodaj: K+-glukonian, 90,68 mg fosfokreatyny di Tris soli, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg²⁺-ATP i 4 mg Na⁺_2-GTP.
   2. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH (100 mM w wodzie destylowanej). Dodaj wodę destylowaną, aby osiągnąć końcową objętość 20 ml. W razie potrzeby dostosuj osmolarność sacharozą (100 mM w wodzie destylowanej) do 280 - 290 mOsm. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 124 mM K+-glukonianu, 10 mM fosfokreatyny di Tris soli, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mM Mg²⁺-ATP i 0,3 mM Na⁺_2-GTP.
   3. Podwielokrotne roztwory wewnątrzkomórkowe rozmieścić w probówkach o pojemności 1 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C. Stosować jedną porcję na dobę i przechowywać w temperaturze 4 °C podczas eksperymentów.
2. Nagrania z zaciskiem krosowym całej komórki
   1. Plastry umieścić w komorze zanurzeniowej i perfaktorować (1,5 ml/min) utlenowanym (95%_O2 - 5% CO₂) aCSF zawierającym następujących antagonistów receptora: selektywnego antagonistę receptora NMDA kwas 2-amino-5-fosfonowalerianowy (APV, 40 μM), kompetycyjny antagonista receptora glutaminianu AMPA/Kainate 6-cyjano-7-nitrochinoksalino-2,3-dionu (CNQX, 10μM), antagonistę receptora glicyny strychninę (STR, 10 μM), swoisty antagonista receptora GABA_A gabazyna (GBZ, 10 μM) i tetrodotoksyna blokująca kanał sodowy (TTX, 3μM)
      Napełnij pipety krosowe rejestrujące (rezystancja 2-7 MΩ; wykonane ze zwykłych, dostępnych w handlu grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i średnicy wewnętrznej 0,6 mm) wewnątrzkomórkowym roztworem o wysokiej zawartości K+, używając dostępnych w handlu wypełniaczy do pipet krosowych z filtrem roztworu. Włóż pipetę do uchwytu wzmacniacza. Zastosować niewielkie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml połączonej z uchwytem na pipety za pomocą silikonowej rurki podłączonej do zaworu trójdrogowego. Podłącz tylną część uchwytu pipety do patch clamp amplifier.
   2. Przesunąć pipetę rejestrującą za pomocą mikromanipulatora mechanicznego w pobliże jądra PPN za pomocą obiektywu 4X w połączeniu z interferencyjną optyką kontrastową w bliskiej podczerwieni.
      nuta: Jądro PPN można zaobserwować w warstwach grzbietowych do górnej szypułki móżdżku (SCP; obserwowalny jako gruby wiązka aksonów). Pipety rejestrujące znajdowały się w PPN pars compacta, który znajduje się bezpośrednio grzbietowo do tylnego końca szypułki.
   3. Doprowadź pipetę rejestrującą do kontaktu z neuronem PPN podczas wizualizacji za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie i szybko zastosuj ujemne ssanie, aby utworzyć uszczelnienie z komórką.
   4. Użyj oprogramowania do uszczelniania zacisków napięciowych, aby monitorować rezystancję pipety podczas ujemnego ssania zgodnie z protokołem producenta.
      1. Gdy ujemne ssanie jest powoli zwiększane, a wartości rezystancji odczytywane przez monitor patch-clamp na końcówce pipety osiągają 80 - 100 MOhm, szybko zmień potencjał trzymania na -50 mV i uwolnij podciśnienie. Zacznij w sposób ciągły stosować ujemne ssanie, aż do pęknięcia błony neuronu i uzyskania dostępu elektrycznego w konfiguracji całej komórki.
      2. Jeśli wartości rezystancji dostępu zmierzone przez oprogramowanie do uszczelek zaciskowych wynoszą 10 MOhm lub więcej, kontynuuj stosowanie ujemnego ssania w mniejszych ilościach.
   5. Kompensacja pojemności (tj. wolnych i szybkich stanów przejściowych obserwowanych po pęknięciu membrany ogniwa) i rezystancji szeregowej w trybie cęgów napięciowych. Przełącz tryb nagrywania na cęgi prądowe i szybko skompensuj wartości mostka (np. przesuń pokrętło wzmacniacza lub kliknij menu automatycznej kompensacji za pomocą myszy komputera).
      1. Stale monitoruj spoczynkowy potencjał błonowy neuronu PPN rejestrowany przy użyciu protokołu producenta. Jeśli spoczynkowy potencjał błony przesuwa się w kierunku wartości depolaryzacyjnych lub hiperpolaryzacyjnych, należy użyć niewielkich ilości prądu stałego (do 100 pA), aby utrzymać optymalną wartość końcową -50 mV.
         nuta: Utrzymuj tylko neurony PPN o stabilnym spoczynkowym potencjale błonowym (RMP) -48 mV lub więcej hiperpolaryzacji (tj. RMP < -48 mV).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sacharoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S8501	C12H22O11, masa cząsteczkowa = 342.30
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S6014	NaHCO3, masa cząsteczkowa = 84,01
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3911	KCl, masa cząsteczkowa = 74.55
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9272	MgCl2 · 6H2O, masa cząsteczkowa = 203.30
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C3881	CaCl2 · 2H2O, masa cząsteczkowa =147,02
D-(+)-glukoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5767	C6H12O6, masa cząsteczkowa = 180.16
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5960	C6H8O6, masa cząsteczkowa =176,12
chlorek sodu	Acros Organics	327300025	NaCl, masa cząsteczkowa = 58.44
Glukonian potasu	Sigma-Aldrich	Klasa G4500	C6H11KO7, masa cząsteczkowa = 234.25
Sól di(tris) fosfokreatyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, masa cząsteczkowa = 453.38
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, masa cząsteczkowa = 238.30
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, masa cząsteczkowa = 380.40
Sól magnezowa adenozyno-5'-trifosforanu	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, masa cząsteczkowa = 507,18
Sól sodowa 5'-trifosforanu guanozyny (hydrat	Sigma-Aldrich	Telefon komórkowy G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, masa cząsteczkowa = 523,18
Cytrynian tetrodotoksyny	Laboratoria Alomone	T-550	C11H17N3O8, masa cząsteczkowa = 319.27
Kwas DL-2-amino-5-fosfonowalerianowy	Sigma-Aldrich	Ciągnik siodłowy A5282	C5H12NO5P, masa cząsteczkowa = 197,13
CNQX sól disodowa hydrat	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, masa cząsteczkowa = 276,12
strychnina	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, masa cząsteczkowa = 334.41
Chlorowodorek mekamylaminy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9020	C11H21N · HCl, masa cząsteczkowa = 203,75
Gabazyna (SR-95531)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S106	C15H18BrN3O3, masa cząsteczkowa = 368,23
Chlorowodorek ketaminy	Mylan	Tel. katalogowy: 67457-001-00
mikroskop	Nikon	Eclipse E600FN
Mikromanipulator	Instrumenty Sutter	Wskaźnik ROE-200
Mikromanipulator	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał MPC-200
wzmacniacz	Urządzenia molekularne	Zacisk wielozaciskowy 700B
Przetwornik A/C	Urządzenia molekularne	Digidata 1440A
grzejnik	Instrumenty Warnera	TC-324B
pompa	Cole'a-Parmera	Masterflex L/S 7519-20
Wkład pompy	Cole'a-Parmera	Masterflex 7519-85
Ściągacz do pipet	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał P-97
kamera	Obrazowanie Q	RET-200R-F-M-12-C
Wibratomizm	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Układ chłodniczy	Instrumenty wibratome	Zobacz materiał 900R
sprzęt
mikroskop	Nikon	Eclipse E600FN
mikromanipulator	Instrumenty Sutter	Wskaźnik ROE-200
mikromanipulator	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał MPC-200
wzmacniacz	Urządzenia molekularne	Zacisk wielozaciskowy 700B
Przetwornik A/C	Urządzenia molekularne	Digidata 1440A
grzejnik	Instrumenty Warnera	TC-324B
pompa	Cole'a-Parmera	Masterflex L/S 7519-20
wkład pompy	Cole'a-Parmera	Masterflex 7519-85
ściągacz do pipet	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał P-97
kamera	Obrazowanie Q	RET-200R-F-M-12-C

powiedział: TGL powiedział: (wersja angielska) ) powiedział: