Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Streszczenie

Źródło: Jarriault, D., et al. Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się stymulator zapachu i rejestruje się aktywność elektrofizjologiczną załatanej komórki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zwierzęta

1. Użyj genetycznie zmodyfikowanych myszy OR-IRES-tauGFP (OR = receptor węchowy, IRES = wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu, tauGFP = białko tau-zielonej fluorescencji) dostępne w Jackson Laboratory. Myszy te zostały opracowane w laboratorium dr Petera Mombaertsa w celu analizy celowania aksonów i rozwoju układu węchowego. Na przykład linia MOR23-IRES-tauGFP, numer katalogowy 006643, nosi oficjalną nazwę szczepu B6; 129P2-Olfr16tm2Mamo/MamoJ; podobnie linia SR1-IRES-tauGFP o numerze magazynowym 6717 nosi oficjalną nazwę B6; 129P2-Olfr124tm1Mamo/MamoJ.
2. Jeśli chodzi o wiek zwierząt: w celu uzyskania lepszych wyników protokołu należy używać zwierząt w wieku od 2 do 4 tygodni. W tej grupie wiekowej rozwarstwienie jest łatwiejsze (bardziej miękkie kości, mocniejszy nabłonek węchowy), a guzki dendrytyczne są większe w porównaniu ze starszymi zwierzętami.

2. Przygotowanie elektrod i roztworów

1. W przypadku pipet stymulujących: należy zakupić wstępnie naciągnięte pipety stymulacyjne. W przeciwnym razie przygotuj je ręcznie.
   1. Za pomocą płomienia zegnij sześć szklanych pipet o średnicy 1 mm w odległości około 1 cm od końcówki. Włóż te sześć pipet oraz prostą rurkę termokurczliwą o średnicy 7 cala o średnicy 1,5 cm wzmocnioną oczkiem.
   2. Rurka termokurczliwa się, aby beczki były ze sobą połączone. Przymocuj dodatkową rurkę termokurczliwą do drugiego końca beczek. Pociągnij tę stymulującą pipetę za pomocą ściągacza wielobębnowego.
   3. Dodaj trochę białego płynnego kleju wokół oczka, aby wzmocnić wygięte końcówki. Pozostaw do wyschnięcia na noc (O/N).
2. Przygotować 1 lub 2 l normalnego roztworu zewnątrzkomórkowego Ringera (w mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO₄ 1,3, CaCl₂ 2, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1,25, glukoza 15; pH 7,6 i 305 mOsm). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór podstawowy (w mM): KCl 70, KOH 53, kwas metanosulfonowy 30, glikol etylenowy kwas tetraoctowy (EGTA) 5, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) 10, sacharoza 70; pH 7,2 (KOH) i 310 mOsm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Dobre przez kilka tygodni.
4. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący z nystatyną doraźnie (w ostatniej chwili) przed eksperymentem.
   1. Odważyć 3 mg nystatyny, dodać 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO); wirować przez 20 sekund, a następnie sonikować przez 2-3 minuty, aż do całkowitego rozcieńczenia.
   2. Dodać 20 μl roztworu DMSO-nystatyny do 5 ml wewnątrzkomórkowego roztworu podstawowego. Wirować 20 sekund, a następnie sonikować 3 minuty. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed bezpośrednim działaniem światła, nystatyna jest wrażliwa na światło. To rozwiązanie może być używane przez kilka godzin. Wymieniaj codziennie.
   3. Gdy preparat nabłonka węchowego znajdzie się pod mikroskopem, należy pobrać część tego roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml z wydłużoną żółtą końcówką w celu napełnienia elektrod; chronić przed bezpośrednim światłem. Po osiągnięciu temperatury pokojowej (RT) roztwór nystatyny nie jest stabilny; Roztwór należy wymieniać w strzykawce o pojemności 1 ml co godzinę lub przechowywać w lodzie.
5. Pociągnij elektrody rejestrujące za pomocą ściągacza, aby uzyskać długą szyjkę i małą końcówkę (~2 μm) o rezystancji 15-20 MΩ z wewnętrznym roztworem nystatyny.
6. Przygotować roztwór nawaniacza o stężeniu 0,5 m w DMSO pod wyciągiem wyciągowym; porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Rozcieńczyć środek zapachowy w roztworze Ringera do uzyskania pożądanego stężenia. Napełnij pipetę stymulującą.

3. Przygotowanie nabłonka węchowego

Uwaga: myszy OR-IRES-tauGFP wyrażają tauGFP pod kontrolą promotora OR. U tych myszy wszystkie neurony wyrażające interesujący nas OR są oznaczone GFP. Protokół ten jest dostosowany do sal operacyjnych wyrażonych we wszystkich strefach. Jednak sekcje i zapisy są łatwiejsze w przypadku OR wyrażonych w strefie grzbietowej.

1. Znieczulić zwierzę, wstrzykując mieszaninę ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 150 mg/kg i 10 mg/kg masy ciała). Dekapitację można wykonać ostrymi nożyczkami w przypadku młodych myszy lub odpowiednio konserwowaną gilotyną dla gryzoni w przypadku starszych myszy.
   1. Za pomocą nożyczek do preparowania pierścieni wykonaj podłużne nacięcie przyśrodkowe przez skórę grzbietową. Usuń skórę, rozsuwając ją. Za pomocą nożyczek przetnij dolne szczęki w stawie szczękowym. Usuń górne przednie zęby za pomocą cięcia koronalnego równoległego do zębów.
   2. Wykonaj przecięcie koronalne głowy za oczami i zachowaj tylko przednią część głowy. Zanurz go w lodowatym roztworze Ringera do sekcji pod lunetą.
2. Wypreparuj pod lunetą: po stronie brzusznej wykonaj podłużne cięcie wzdłuż górnej szczęki/zębów. Przetnij kości grzbietowe wzdłużnie, podążając za grzbietowo-boczną stroną jamy nosowej. Usuń większość kości i podniebienia; przenieść przegrodę i przyczepiony do niej nabłonek w natlenizowanym Ringerze w RT.
3. Do końcowej sekcji: Tuż przed rozpoczęciem sesji nagraniowej oderwij nabłonek od leżącej poniżej przegrody za pomocą kleszczy. Odłącz nabłonek za pomocą kleszczy i dwóch nacięć nożycowych 4-5 mm (użyj nożyczek micro-vannas) w przedniej części przegrody, gdzie zrost jest silniejszy.
   1. Ostrożnie usuń narząd lemieszowo-nosowy, wycinając go wzdłuż jego grzbietowego połączenia z nabłonkiem przegrody. Przenieś nabłonek do komory rejestracyjnej z warstwą śluzu skierowaną do góry; Trzymaj go płasko w komorze z harfą.
4. Zainstaluj komorę pod mikroskopem pionowym wyposażonym w optykę fluorescencyjną i czułą kamerę. Wizualizuj przygotowanie na ekranie komputera w dużym powiększeniu dzięki 40-krotnemu obiektywowi zanurzeniowemu w wodzie (apertura numeryczna 0,8) i dodatkowemu powiększeniu 2X lub 4X uzyskanemu przez soczewkę powiększającą. Napełniać w sposób ciągły natlenionym Dzwonkiem przy temperaturze pokojowej (1-2 ml/min).

4. Sesja nagraniowa

1. Poszukiwanie komórek fluorescencyjnych: wzbudzić preparat o długości fali 480 nm dla EGFP, który emituje światło w zakresie 530-550 nm; celować w jedną gałkę dendrytyczną, która jest niezawodnie widoczna we fluorescencji i w jasnym polu.
2. Napełnij elektrodę roztworem wewnątrzkomórkowym z nystatyną; usuń pęcherzyki, delikatnie stukając w elektrodę.
3. Włóż elektrodę do uchwytu elektrody, zastosuj nadciśnienie w pipecie; Rezystancja powinna wynosić 15-20 MΩ.
4. Zbliż elektrodę do ogniwa; gdy rezystancja osiągnie ~40 MΩ, zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby osiągnąć gigaseal.
5. Po osiągnięciu uszczelnienia należy ustawić potencjał membrany na około -75 mV;
6. Po otwarciu komórki przystąp do protokołów stymulacji, leczenia farmakologicznego. Aby zmierzyć reakcję na pojedynczą stymulację odorantem, zarejestruj 200-500 ms spontanicznej aktywności, stymuluj przez 500 ms i mierz odpowiedź komórki przez maksymalnie 10 sekund. W przypadku leczenia farmakologicznego należy perfuzjować środki farmakologiczne w pożądanym stężeniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ciężki sprzęt
stół wibracyjny z klatką Faradaya	TMC (Międzynarodowa Organizacja T	SERIA 63-500	wymagane: izoluje system rejestrujący od drgań indukowanych przez otoczenie (ruchy eksperymentatora, wibracje urządzeń, takich jak wentylatory do chłodzenia komputerów itp.); może być również zakupiony z klatką Faradaya lub wyposażony w specjalnie wykonaną klatkę Faradaya; klatka ta jest zalecana, aby uniknąć hałasu elektrycznego z otoczenia
optyka
mikroskop	Olympus	BX51WI	mikrokopa pionowa wyposażona w epifluorescencję; stolik stały lub ruchomy w zależności od preferencji użytkownika
Cele	Olympus	LUMPLFL40XW	wymagane są co najmniej 2 obiektywy: 4X lub 10X do zgrubnego podejścia do celi oraz 40-krotne zanurzenie na dużą odległość Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM
Lupa	Olympus	U-TVCAC	BEZWZGLĘDNIE WYMAGANE: umieszczony na drodze światła między obiektywem a kamerą; pozwala na powiększenie obrazu na ekranie w celu precyzyjnego dotarcia do pokrętła z elektrodą rejestrującą
kamera	Olympus	Zobacz materiał DP72	Dobra kamera jest potrzebna, aby zobaczyć neurony we fluorescencji, jak również w jasnym polu; oprogramowanie sterujące jest proste i pozwala na robienie zdjęć i wykonywanie obrazu z kamery na żywo w celu monitorowania zbliżania się elektrody do komórki. Ultraczuły aparat fotograficzny nie jest konieczny
Filtry	Olimp/Barwa		w zależności od białka fluorescencyjnego zastosowanego u myszy; przykład dla GFP: wzbudzenie: BP460-490: emisja: HQ530/50m
Elektrody/system rejestrujący
wzmacniacz	HEKA powiedział:	EPC10 USB	monitoruje prądy przepływające przez elektrodę rejestrującą, a także kontroluje zaciąganie się, wysyłając sygnał TTL do spritzera; konfiguracja EPC10 to sterowany komputerowo
oprogramowanie	HEKA powiedział:	Mistrz Łat	steruje wzmacniaczem podczas eksperymentu
mikromanipulator	Sutter	Odtwarzacz MP225	precyzyjny mikromanipulator, umożliwia precyzyjne ruchy z dokładnością do 1/10 mikrometra; ten model jest bardzo stabilny; unikaj manipulatorów hydraulicznych, które mogą dryfować
ściągacz elektrod	Sutter	Zobacz materiał P97	z włóknem FT345-B o szerokości rynny; do przygotowania pipet rejestrujących o średnicy około 2 μm z długą końcówką docierającą do komórek; rezystancja powinna wynosić od 15 do 20 Mohm z perforowanym roztworem zacisku krosowego
szkło	Sutter	Zobacz materiał BF120-69-10 Zobacz materiał BF120-69-10	W naszych warunkach nagrywania szkło to jest idealne do nagrywania pipet
komora nagraniowa	Instrumenty Warnera	RC-26G	Do ustawienia preparatu pod mikroskopem potrzebna jest komora. Aby utrzymać preparat w środku komory, należy użyć siatki/kotwy.
stymulacja
szkło	Wskaźnik WPI	TW100F-4	Pipety te, połączone w grupy po 7 sztuk, służą do przygotowania wstępnie naciągniętych pipet stymulujących
ściągacz wielolufowy	Mdi	PMP-107-Z	Dzięki połączeniu ciągnięcia i skręcania, ściągacz ten pozwala nam przygotować elektrody dmuchające z 7 beczkami
precyzyjny wtryskiwacz ciśnieniowy	Firma Toohey	P/N T25-1-900 Pojedynczy kanał	ten precyzyjny wtryskiwacz ciśnienia kontroluje ciśnienie wyrzucane w ściągaczu wielolufowym; jest sterowany ręcznie lub przez wzmacniacz za pomocą 5V TTLs
mikromanipulator	Narishige powiedział:	TY-1	Wystarczy zgrubny manipulator, aby zbliżyć elektrodę zaciągającą się do miejsca nagrania
Rurki
roztwory/perfuzja/chemikalia
pompa próżniowa	Gardner Denver
system perfuzyjny	N/a	N/a
Nystatyna	Sigma-Aldrich	Nr kat. N3503	Obowiązkowe wykonanie roztworu wewnętrznego dla perforowanego zacisku krosowego
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5879	Służy do rozpuszczania nystatyny do roztworu wewnętrznego do łaty perforowanej
chlorek sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9625	Roztwór zewnątrzkomórkowy
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4504	Roztwór wewnątrzkomórkowy/zewnątrzkomórkowy
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C7902	Roztwór zewnątrzkomórkowy
Sodu fosforan jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9638	Roztwór zewnątrzkomórkowy
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4,7H2O)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 63140	Roztwór zewnątrzkomórkowy
glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8270	Roztwór zewnątrzkomórkowy
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S6297	Roztwór zewnątrzkomórkowy
EGTA (Kwas bis(2-aminoetyloetero)-glikolu etylenowego-N,N′,N′-tetraoctowego)	Sigma-Aldrich	E3889	Rozwiązanie wewnętrzne
Hydroksyd potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1767	Rozwiązanie wewnętrzne
Sulftlenek metylu	Sigma-Aldrich	W387509	roztwór wewnątrzkomórkowy
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał H7006	roztwór wewnątrzkomórkowy
sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389	roztwór wewnątrzkomórkowy

TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: