Rejestrowanie zmian w aktywności nerkowego nerwu współczulnego w odpowiedzi na ciśnienie tętnicze u szczurów

Streszczenie

Źródło: Fink, A. M., et al. Ilościowe określanie ostrych zmian w aktywności nerkowego nerwu współczulnego w odpowiedzi na manipulacje ośrodkowego układu nerwowego u znieczulonych szczurów. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę badania aktywności nerkowych nerwów współczulnych (RSN) w odpowiedzi na zmiany ciśnienia tętniczego u szczurów. Po podłączeniu cewnika wyczuwającego ciśnienie do tętnicy udowej nerkowe nerwy współczulne są odsłonięte. Nerwy są następnie przenoszone na elektrodę rejestrującą i rejestrowana jest ich aktywność elektryczna. Następnie wstrzykuje się lek zwężający naczynia krwionośne w celu podniesienia ciśnienia krwi i monitoruje odpowiednie zmiany w aktywności RSN.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Utwórz bipolarne elektrody RSNA

1. Aby utworzyć elektrodę, wytnij dwa kawałki drutu ze stali nierdzewnej o długości około 18 mm każdy. Wytnij jeden kawałek rurki polietylenowej (PE-50) o długości około 15 mm. Włóż oba kawałki drutu do rurki, pozostawiając drut wystający z obu końców.
2. Usuń izolację z końców przewodów; przytnij przewody, pozostawiając 2-3 mm odsłoniętego drutu. Z jednej strony zaciśnij męskie piny na odsłoniętym przewodzie. styki bezpiecznie do przewodu, zabezpiecz styki wewnątrz listwy łączącej i zakryj połączenie żywicą epoksydową.
   nuta: Alternatywnym podejściem, które pozwala uniknąć, jest użycie szybkozłączek/odczepianych zacisków krokodylkowych.
3. Na przeciwległym końcu elektrody usuń izolację z końców przewodów, pozostawiając 2-3 mm odsłoniętego drutu. Zegnij tę część przewodów, aby utworzyć małe haczyki w kształcie litery "V" w nieizolowanym przewodzie.
   nuta: Jest to część elektrody, która będzie miała kontakt z nerkowym nerwem współczulnym. Ważne jest, aby uszczelnić ten koniec, aby zapobiec przedostawaniu się płynów do rurki. Skutecznie można użyć silikonu lub żywicy epoksydowej.

2. Podać znieczulenie i przygotować miejsca operacji

1. Podaj znieczulenie samcowi szczura Sprague Dawley (w wieku 9-11 tygodni, o wadze 150-400 g). Pentobarbital sodu należy podawać w dawce 50 mg/kg mc. we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP). Aby ocenić stabilną płaszczyznę znieczulenia podczas operacji, sprawdzaj odruch szczypania palców u nóg co 15 minut i w razie potrzeby ponownie dozuj znieczulenie.
   nuta: Pentobarbital sodu (Nembutal) był stosowany w poprzednich badaniach w celu uzyskania trwałej płaszczyzny znieczulenia bez zakłócania modulacji RSNA. Protokół ten jest przeznaczony do operacji bez przeżycia, więc nie ma okresu rekonwalescencji/monitorowania pooperacyjnego.
2. Przygotuj miejsce operacji zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami (tj. ogol brzuch, grzbiet i głowę szczura; oczyść skórę 10% roztworem jodu powidonu; nałóż lubrykant do oczu i umieść szczura na poduszce grzewczej). Podczas eksperymentów utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C.

3. Kantonacja tętnicy udowej w celu monitorowania średniego ciśnienia tętniczego

1. Wizualizuj tętnicę pod mikroskopem. Podobnie jak w przypadku metody stosowanej do kaniulacji żylnej, zawiąż szew dystalny, aby zamknąć tętnicę; Przymocuj krawędzie tego szwu do pola operacyjnego za pomocą jedwabnej taśmy i ustaw tętnicę prostopadle do dominującej ręki chirurga.
2. Dostęp do tętnic w przypadku korzystania z telemetrii
   1. Sprawdź cewnik wykrywający ciśnienie w dużym powiększeniu przed kaniulacją tętniczą. Upewnij się, że cewnik jest wolny od pęcherzyków/zanieczyszczeń i ma nienaruszoną łąkotkę między elementami wypełnionymi płynem (proksymalnym) i żelem (dystalnymi). Przed każdą implantacją należy uzupełnić żel na dystalnej końcówce cewnika. Włącz nadajnik za pomocą magnesu; monitorować ciśnienie krwi (BP) podczas zabiegu, aby wytrzymać idealne umiejscowienie.
   2. Użyj luźnego półwęzła od góry w proksymalnym szwie, aby na krótko zamknąć tętnicę udową. Trzymaj wprowadzacz cewnika w ręce niedominującej. Przytrzymaj końcówkę kaniuli jednostki telemetrycznej za pomocą kleszczy do kaniulacji naczyń, aby uniknąć wyparcia żelu z końcówki.
   3. Nakłuć otwór w tętnicy wygiętą igłą 22G i wprowadzić kaniulę do tętnicy za pomocą kleszczy do kaniulacji naczyń, aby uniknąć wyparcia żelu z końcówki. Przesuń kaniulę tak daleko, jak to możliwe. Za pomocą pasaży do szwów proksymalnych i dystalnych zabezpiecz cewnik ciśnieniowy.
   4. Wsuń korpus implantu telemetrycznego do boku przylegającego do nacięcia i zamknij to nacięcie za pomocą nylonowego szwu 4-0 na igle tnącej. Wyłącz urządzenia telemetryczne za pomocą magnesu po zakończeniu okresu nagrywania, aby wydłużyć żywotność baterii.

4. Umieść szczura w ramie do operacji stereotaktycznej, aby uzyskać dostęp do mózgu

1. Delikatnie przesuń szczura do pozycji leżącej w ramie do operacji stereotaktycznej.
2. Umieść szczura między nausznikami i wyreguluj siekacz, aby wyrównać wysokość lambdy i bregmy. Pozycjonowanie może zależeć od szczepu szczura, masy ciała i lokalizacji docelowych celów ośrodkowego układu nerwowego (OUN).
3. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie skalpela rostrocaudal przez linię środkową skóry głowy. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką mocno usuń tkankę łączną z powierzchni czaszki. Nałóż nadtlenek wodoru na czaszkę, aby pomóc w wizualizacji szwów bregma, lambda i linii środkowej.
4. Korzystając z atlasu mózgu szczura do kierowania celowaniem, wywierć osteotomię z otworem w zadziorach, dopasowaną do dostępu do elektrody, przez czaszkę.

5. Izolacja nerkowych nerek współczulnych

1. Podłącz drutową elektrodę RSNA (kroki 1.1-1.3) do 10X pre-amplifier i mikroelektroda amplifier.
2. Odizoluj nerwy nerkowe przez nacięcie zaotrzewnowe przed lub po zabezpieczeniu szczura w ramie stereotaktycznej. Ustaw elektrody RSNA, gdy szczur znajdzie się w ramce stereotaktycznej. Wykonaj nacięcie skalpela rozciągające się od 4-5 cm poniżej żeber w kierunku ogonowym, lekko bocznie do kręgosłupa. Blunt przeprowadza sekcję nacięcia, aby uwidocznić mięśnie przykręgosłupowe.
3. Użyj nożyczek, aby wykonać bardzo powierzchowne 1-2 cm nacięcie rostrocaudalne w miejscu, w którym tłuszcz styka się z mięśniem. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką rozprowadź tłuszcz z dala od mięśnia, aby uwidocznić nerki. Ważne jest, aby nie wchodzić do przestrzeni otrzewnej.
4. Użyj retraktorów, aby delikatnie oddzielić nerkę od mięśni przykręgosłupowych, aby uwidocznić tętnicę nerkową i aortę brzuszną. Nie należy nadmiernie rozciągać naczyń krwionośnych, aby uniknąć uszkodzenia nerwów nerkowych. Użyj bawełnianego gazika o wymiarach 2 x 2 cale nasączonego solą fizjologiczną, aby chronić nerkę przed uszkodzeniem.
5. W dużym powiększeniu zidentyfikuj nerwy nerkowe w kieszonce nacięcia. Pęczki nerwowe są najłatwiej widoczne w kącie prostym utworzonym przez aortę i tętnicę nerkową. Nerwy nerkowe ściśle podążają za tętnicą nerkową od aorty do nerek.
6. Wybierz segment pęczka nerwowego, który zostanie umieszczony na elektrodzie rejestrującej. Delikatnie wypreparuj włókna nerwowe z otaczającej tkanki/naczynia za pomocą pęsety do mikropreparowania.
7. Zabezpiecz drucianą elektrodę RSNA w uchwycie (np. zacisku krokodylkowym przymocowanym do stojaka nośnego). Opuść elektrodę do poziomu segmentu nerwowego. Użyj haczyka nerwowego, aby delikatnie podnieść odcinek nerwu nerkowego na elektrodę bez rozciągania nerwu.
   nuta: Nerw powinien spoczywać wewnątrz obu haczyków w kształcie litery "V" w nieizolowanym przewodzie, równolegle do nerwu. Przewody elektrod nie mogą dotykać żadnych innych tkanek, krwi ani płynu limfatycznego.
8. Wypełnij nacięcie olejem mineralnym, aby zapobiec wysuszeniu odsłoniętego nerkowego nerwu współczulnego. Użyj klipsa uziemiającego tak, aby jednym końcem znajdował się na skórze nacięcia, a drugi był przymocowany do klatki Faradaya.
9. Skieruj sygnał do wzmacniaczy za pomocą filtrowania górno- i dolnoprzepustowego (10 Hz i 3 kHz). Dostosuj wzmocnienie do 10 K. Dołącz monitor audio, aby ocenić wzór pękania RSNA. Używaj częstotliwości próbkowania w zakresie od 2 000 do 10 000 Hz. Użyj zwiększonej częstotliwości próbkowania, gdy przypuszcza się, że manipulacja OUN powoduje szybkie/krótkie reakcje współczulne.

6. Rejestruj dane

1. Oceń jakość zapisu RSNA, wywołując barorerefleks za pomocą wstrzyknięcia dożylnie w bolusie 1 ml soli fizjologicznej lub 10 μg/ml fenylefryny (w 0,1 ml). Jak pokazano na rycinie 1, wlew powinien zwiększać ciśnienie krwi i hamować RSNA. Wzrost średniego ciśnienia tętniczego o 60-80 mmHg jest wystarczający do zahamowania współczulenia nerek.
2. W razie potrzeby wyreguluj położenie elektrod, aby poprawić sygnał. Repozycja jest wymagana, jeśli nerw nie styka się z obydwoma haczykami elektrody lub jeśli jakakolwiek tkanka, krew lub płyn limfatyczny stykają się z przewodami.
   nuta: Potrzeba zmiany pozycji opiera się na charakterystyce słuchowej wyładowań nerwowych.
3. Po uzyskaniu wyraźnego sygnału zabezpiecz elektrodę RSNA na miejscu, pobierając olej mineralny i nakładając żel krzemionkowy w celu zakrycia połączenia nerw/elektroda w kieszonce naciętej. Nie ruszaj szczura, dopóki żel nie stwardnieje całkowicie.
4. Wykonuj protokoły manipulacji OUN, jednocześnie stale rejestrując RSNA i średnie ciśnienie tętnicze. Jeśli mikroiniektor/pulsator jest używany do manipulacji pniem mózgu, sygnał logiczny z tego urządzenia może zostać wprowadzony do nagrań RSNA/BP w celu udokumentowania czasu manipulacji OUN
.
5. Po zakończeniu eksperymentu określ poziom hałasu, miażdżąc nerw proksymalnie do elektrod rejestrujących między żelem krzemionkowym a mięśniem rdzeniowym. Zapisz co najmniej 30 s tej "zerowej" wartości dla RSNA. Jako alternatywne podejście do ilościowego określania hałasu należy podać krótko działający bloker zwojowy, taki jak atropina, heksametonium, chlorisondamina lub winian pentoliny.
6. Ostrożnie wyjmij elektrodę RSNA i usuń wszelkie ślady żelu krzemionkowego z drutów elektrodowych. Zachowaj elektrodę do ponownego użycia. Wyłącz nadajnik telemetryczny i wyjmij go, uważając, aby nie uszkodzić końcówki cewnika.

Wyniki

Rycina 1: RSNA i BP w odpowiedzi na wstrzyknięcie fenylefryny dożylnie.Surowy RSNA (A) był wyprostowany w pełnej fali (B); rektyfikowany kruszony "zero" RSNA jest pokazany we wstawce C. Obliczono nienakładające się na siebie średnie z 10 s (minus szum) (D). Aby wywołać barodruch, wstrzyknięto dożylnie 0,1 ml fenylefryny (1 μg/ml) (w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drut ze stali nierdzewnej	Systemy A-M; Sequim, Waszyngton	Numer katalogowy: 791000	Elektroda RSNA
Rurki z polietylenu (PE-50)	Firma VWR; Radnor, Pensylwania	Nr kat. 63019-048	Elektroda RSNA; kaniulacja naczyń
Miniaturowe złącze pinowe	Systemy A-M; Sequim, Waszyngton	Numer katalogowy: 520200	Elektroda RSNA
Narzędzie do zaciskania	Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, Floryda	Zobacz materiał M22520	Elektroda RSNA
Listwa łącząca	Amfenol; Clinton Township, Michigan,	221-2653	Elektroda RSNA
J-B Kwik Żywica epoksydowa	J-B Weld, Źródła siarkowe, Teksas	Numer katalogowy: 8270	Elektroda RSNA
silikonowy	Permatex; Hartford, Connecticut	Numer katalogowy: 2222	Elektroda RSNA
Heparyna sodowa; Do wstrzykiwań (fiolka 10 ml, 1000 U/ml)	KV Zaopatrzenie weterynaryjne; David City, Nowy Jork	Zobacz materiał P03466	Drożność linii żylnej
Chlorowodorek fenylefryny; Do wstrzykiwań (1 ml fiolka; 10 mg/ml)	Zaopatrzenie chirurgiczne ACE; Brockton, Massachusetts	950-6312	Badanie zahamowania współczulnego nerek
Elastyczne szpilki chirurgiczne z pojedynczym hakiem	Aparatura Harvarda; Holliston, Massachusetts	72-2595	cięcie
Jedwabna taśma chirurgiczna	3M, Minneapolis, MN	1538-0	Bezpieczne pobyty chirurgiczne
Igły, 20 g	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	Z192554-100EA	Kaniulacja naczynia
Kleszcze zakrzywione Dumont #7	Narzędzia Nauk Pięknych; Foster City, Kalifornia	Rozdział 11274-20	Kaniulacja naczynia
5-0 jedwabne opaski do szwów	Braintree Naukowe; Braintree, Massachusetts	SUT-S 106	Kaniulacja naczynia
Delikatne kleszcze hemostatyczne	Roboz Instrument chirurgiczny Co.; Gaithersburg, lekarz medycyny	Złącze RS-7117	Kaniulacja naczyń krwionośnych i chirurgia RSNA
Kleszcze hemostatyczne Crile	Narzędzia Nauk Pięknych; Foster City, Kalifornia	Numer katalogowy: 13004-14	Gięcie igły
Nadajnik telemetryczny	Międzynarodowa Organizacja Nauk o Danych; Minneapolis, MN	PA-10	Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego (telemetria)
Strzykawka do ponownego żelowania	Międzynarodowa Organizacja Nauk o Danych; Minneapolis, MN	276-0038-001	Ponowne użycie nadajnika (telemetria)
Jednorazowy przetwornik ciśnienia	Transpac; San Clemente, Kalifornia	Samolot MI-1224	Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego
Zaparzacz ciśnieniowy Clear-Cuff	MILA International Inc.; Florencja, KY	2281339	Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego
Kleszcze do kaniulacji naczyń	Narzędzia Nauk Pięknych; Foster City, Kalifornia	Numer katalogowy: 00574-11	Wprowadzenie cewnika
monofilamentowy nylon 4-0 szew na odwrotnej igle tnącej	McKesson Medyczno-Chirurgiczny; San Francisco, Kalifornia	S661GX	Bezpieczny nadajnik telemetryczny
Odbiornik telemetrii	Międzynarodowa Organizacja Nauk o Danych; Minneapolis, MN	RPC-1	Monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego (telemetria)
LabChart Pro (oprogramowanie), PowerLab (sprzęt do akwizycji)	Instrumenty AD; Colorado Springs, Kolorado	ML846, macierz MX2 2.0 (zgodna z telemetrią Data Science International)	3 opcje oprogramowania/sprzętu do akwizycji
SciWorks (oprogramowanie), DataWave (sprzęt do akwizycji)	DataWave Technologies, Loveland, Kolorado	N/a
Spike 2 (oprogramowanie), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Londyn, Wielka Brytania	1401-3
Mikro-wiertło	Roboz Instrument chirurgiczny Co.; Gaithersburg, lekarz medycyny	Złącze RS-6300	Operacja ośrodkowego układu nerwowego
Rama do operacji stereotaktycznej	Stoelting; Wood Dale, Illinois	Numer katalogowy: 51600	Operacja ośrodkowego układu nerwowego
Wzmacniacz mikroelektrodowy z przedwzmacniaczem 10X	Systemy A-M; Sequim, Waszyngton	Rocznik 1800-2	Nagranie RSNA
Zwijacze	Narzędzia Nauk Pięknych; Foster City, Kalifornia	Numer katalogowy 17009-07	Nagranie RSNA
Pęseta do mikropreparacji	Narzędzia Nauk Pięknych; Foster City, Kalifornia	Numer katalogowy 11251-10	Nagranie RSNA
Mikro-hak	Narzędzia Nauk Pięknych; Foster City, Kalifornia	Numer katalogowy 10064-14	Nagranie RSNA
olej mineralny	Fisher Naukowy; Waltham, Massachusetts	8042-47-5	Nagranie RSNA
Monitor dźwięku	Systemy A-M; Sequim, Waszyngton	3300	Nagranie RSNA
Żel krzemionkowy	Wacker, München; Niemcy	Zobacz materiał RT601A-B	Nagranie RSNA
Klipsy elektryczne	Tyco Electronics; Szafuza, Szwajcaria	EB0283-000	Uziemienie lub zabezpieczenie igły perfuzyjnej
Nożyczki Bonn, proste/ostre końcówki	Roboz Instrument chirurgiczny Co; Gaithersburg, lekarz medycyny	Złącze RS-5840	Perfuzji
Igła do zgłębnika	Aparatura Harvarda; Holliston, Massachusetts	Nr kat. 75-0286	Perfuzji
Pompa perfuzyjna Masterflex	Cole'a-Parmera; Vernon Hills, Illinois	Zobacz materiał 7524-10	Perfuzji
Rurki silikonowe Masterflex utwardzane platyną	Cole'a-Parmera; Vernon Hills, Illinois	Numer katalogowy 96410-15	Perfuzji
Formalina (10% roztwór buforowy; 4 l)	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	HT501128	Perfuzji
sacharoza	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	S0389	Krioprotekcja