$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowania
- Zaprojektuj i zbuduj odpowiednie narzędzie do wprowadzania, które przejściowo przenosi sondę silikonową i łącznik elektrody podczas procesu implantacji. Na rysunku 1 przedstawiono przykładowe niestandardowe narzędzie do wstawiania.
- Ostrożnie wyjmij silikonową sondę i złącze elektrody z opakowania za pomocą kleszczyków z ceramiczną końcówką.
- Podnieś płytkę złącza i bezpiecznie zamocuj ją za pomocą krokodylka clamp przymocowany do stojaka.
- Za pomocą stereoskopu wyrównaj sondę z narzędziem do wkładania za pomocą kleszczyków z ceramiczną końcówką. Nałożyć warstwę wosku parafinowego o grubości ~2 mm stopionego za pomocą kauteryzatora, aby przykleić sondę do narzędzia wprowadzającego. Uważaj, aby nie dotykać trzonków sondy podczas tej procedury.
- Przymocuj złącze elektrody do trzonka narzędzia do osadzania za pomocą standardowej taśmy klejącej. Należy pamiętać, że w zależności od producenta, przewody uziemiające mogą wymagać przylutowania do płytki złącza elektrody przed implantacją. Usunąć izolację z dwóch krótkich odcinków drutu miedzianego izolowanego lakierem za pomocą lutu cynowego nałożonego za pomocą lutownicy (400 °C). przewody uziemiające do odpowiednich szczelin w płytce złącza elektrody.
- Usuń izolację dwóch dodatkowych kawałków drutu miedzianego. Owiń każdy nieizolowany drut miedziany trzy razy wokół ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm, długość 2 mm). Zastosuj topnik odpowiedni do stali i drut miedziany do dolnej części nakrętki. Upewnij się, że dolna połowa gwintu pozostaje wolna od lutu cynowego.
- Użyj standardowego multimetru, aby sprawdzić, czy między przewodem a śrubą nie ma kontaktu elektrycznego.
- Zdezynfekuj trzpienie sondy silikonowej i uziemiające przez zanurzenie w 70% etanolu (10 s).
- Przygotuj osłonę ochronną dla implantu sondy, przecinając główkę plastikowej pipety Pasteura na pół.
2. Chirurgia implantologiczna
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze z cienką końcówką, zaciski chirurgiczne) za pomocą sterylizatora z gorącymi koralikami. Przetrzyj wszystkie powierzchnie 70% etanolem.
- Wywołać znieczulenie 3% izofluranem w tlenie podawanym w tempie ~1 l/min.
- Do konserwacji należy użyć 1 - 1,5% izofluranu. Należy pamiętać, że stężenie izofluranu wymagane do osiągnięcia tolerancji chirurgicznej może się różnić w zależności od zwierzęcia.
- Stabilną tolerancję chirurgiczną uzyskuje się, gdy zwierzę nie reaguje na szczypanie palcami. Monitoruj częstość oddechów myszy i w razie potrzeby dostosuj stężenie izofluranu.
- Nałóż maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu.
- Zamontuj mysz w ramce stereotaktycznej, delikatnie wkładając paski douszne do kanału słuchowego. Gdy głowa myszy zostanie ustabilizowana przez paski uszne, umieść ustnik na pysku, aby zapewnić ciągłe dostarczanie izofluranu. Umieść mysz na ręczniku lub podkładce nad poduszką grzewczą i wstrzyknij podskórnie buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg masy ciała), aby zapewnić analgezję pooperacyjną.
- Ogol głowę standardową golarką i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze wzdłuż linii środkowej czaszki i otwórz skórę za pomocą zacisków chirurgicznych.
- Wyrównaj głowę zwierzęcia za pomocą narzędzia do wyrównywania stereotaktycznego, aby wypoziomować bregmę i lambdę. Wysokość przesunięta między bregmą a lambdą powinna być mniejsza niż 50 μm. Ponadto wypoziomuj głowę wzdłuż osi przyśrodkowej-bocznej, mierząc głębokość od bregmy na powierzchni czaszki w określonych odległościach po lewej i prawej stronie (np. 1 mm w lewo i po prawej stronie bregmy). W razie potrzeby wyreguluj nachylenie głowy.
- Oczyść głowę 3% wodą utlenioną i wytrzyj do sucha sterylnymi bawełnianymi chusteczkami.
- Określ położenie kraniotomii względem bregmy za pomocą odpowiedniego atlasu stereotaktycznego.
- Za pomocą głowicy wiertarskiej 0,9 mm wywierć dwa otwory w kości nad móżdżkiem, aby umieścić szlifowane i referencyjne. Dodatkowo pożądane są 1 - 3 otwory na kotwiące w celu ustabilizowania implantu. Lokalizacja kotwiących będzie zależeć od lokalizacji kraniotomii. W celu implantacji do hipokampa umieść kotwiące na przeciwległej korze czołowej ciemieniowej i ipsilateralnej. Wkręć w kość za pomocą odpowiedniego śrubokręta. Uważaj, aby nie przeniknąć do mózgu.
- Kraniotomię należy wykonać, powoli rozrzedzając czaszkę wiertłem w prostokątnym obszarze po stronie implantacji. Często zwilżaj kość wysterylizowanym buforem fosforanowym (PB). Pozostałą przerzedzoną czaszkę można delikatnie przekłuć i usunąć za pomocą cienkiej (27G) igły iniekcyjnej i pęsety.
- Ostrożnie przekłuć oponę twardą cienką (27G) igłą do wstrzykiwań. Uformuj mały haczyk, zginając końcówkę igły pęsetą i pociągnij oponę twardą w celu usunięcia. Zastosuj PB, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu.
- Zamontuj narzędzie do wprowadzania elektrod na uchwycie stereotaktycznym, wyzeruj sondę na bregmie i przesuń sondę do współrzędnych stereotaktycznych nad kraniotomią. Powoli przenikaj do powierzchni mózgu. Upewnij się, że wałki sondy nie są wygięte. Unikaj implantacji przez naczynia krwionośne.
- Powoli opuść sondę do ~200 μm powyżej żądanej głębokości. Przykryj kraniotomię i trzonki sondy silikonowej wysterylizowaną wazeliną dla ochrony. Nałóż cement dentystyczny, aby przymocować podstawę sondy do kotwiącej w czaszce.
- Zaraz po nałożeniu cementu powoli przesuń sondę na docelową głębokość. Przesunięcie ostatnich ~200 μm po nałożeniu cementu zmniejsza ruch boczny sondy i zapewnia minimalne uszkodzenie tkanki w obszarze docelowym. Należy pamiętać, że czas utwardzania użytego cementu może mieć wpływ na ten etap protokołu. W przypadku szybko utwardzającego się cementu pomiń ten krok i bezpośrednio wszczepij sondę na docelową głębokość, aby uniknąć uszkodzenia sondy silikonowej.
- Po utwardzeniu cementu zwolnij sondę z narzędzia do wkładania, topiąc wosk za pomocą kauteryzatora.
- Zwolnij płytkę łączącą z urządzenia do wkładania i umieść ją w odpowiednim miejscu na czaszce za pomocą krokodylka clamp przymocowany do uchwytu do wkładania. W przypadku implantacji sondy do hipokampa, umieść płytkę łączącą na przeciwległej kości ciemieniowej. Przymocuj płytkę łączącą do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.
- przewody uziemiające i odniesienia płytki złącza do przewodów przymocowanych do dwóch nad móżdżkiem.
- Przytnij osłonę ochronną do odpowiedniej wysokości i umieść ją na sondzie silikonowej. Przymocuj pokrywę do płytki łączącej i czaszki za pomocą cementu dentystycznego, omijając skórę wokół odsłoniętej czaszki. Zszywanie skóry wokół miejsca implantacji zwykle nie jest wymagane.
3. Rekonwalescencja po operacji
- Przez co najmniej 2 dni należy stosować odpowiednie leczenie przeciwbólowe (np. podskórne wstrzyknięcia buprenorfiny co 6 godzin w ciągu dnia i do wody pitnej na noc w połączeniu z karprofenem (4 - 5 mg/kg masy ciała) podskórnie co 24 godziny). Zalecana jest pojedyncza obudowa, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.
- Odczekaj co najmniej tydzień na regenerację. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
4. Akwizycja danych
- Rejestruj LFP od swobodnie poruszających się myszy za pomocą odpowiedniego systemu akwizycji danych połączonego przez komutator. Aby uzyskać LFP, należy użyć częstotliwości próbkowania 1 - 5 kHz. Wyższe częstotliwości próbkowania (20 - 30 kHz) są wymagane, jeśli wyładowania pojedyncze jednostki mają być rejestrowane wraz z LFP.
- Przechowuj surowe pliki nagrań poszczególnych kanałów do analizy w trybie offline.
