Artykuł metodologiczny

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

21.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3122

⸱

3 stycznia 2012

 , 
1Centre for Immunity, Infection and Evolution, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Streszczenie

Większość zgonów z powodu malarii u ludzi jest spowodowana pasożytami Plasmodium falciparum w stadium krwi. Malaria mózgowa, najgroźniejsze powikłanie tej choroby, charakteryzuje się gromadzeniem zakażonych Plasmodium falciparum czerwonych krwinek (iRBC) w stadium pigmentowanych trofozoitów w mikrokrążeniu mózgu2-4. Ta niedrożność mikronaczyniowa (sekwestracja) prowadzi do kwasicy, hipoksji i wydzielania szkodliwych cytokin zapalnych (przegląd w 5). Sekwestracja występuje również w większości tkanek mikrokrążenia w organizmie człowieka2, 3. Mechanizm, w którym iRBC przytwierdzają się do ścian naczyń krwionośnych, nie jest jeszcze dobrze poznany.

Unieśmiertelniona linia ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu (HBEC-5i) była wykorzystywana jako model in vitro bariery krew-mózg6. Jednakże iRBC Plasmodium falciparum słabo przylegają do komórek HBEC-5i in vitro, co różni się od gęstej sekwestracji występującej w przypadkach malarii mózgowej. Opracowaliśmy zatem test przeglądowy (panning assay) w celu selekcji (wzbogacenia) różnych szczepów P. falciparum pod kątem adhezji do HBEC-5i, aby uzyskać populacje pasożytów o wysokim stopniu wiązania, bardziej reprezentatywne dla zjawisk zachodzących in vivo.

Próbkę hodowli pasożytów (mieszaninę iRBC i niezinfekowanych RBC) w stadium pigmentowanych trofozoitów poddaje się przemywaniu, a następnie inkubuje na warstwie komórek HBEC-5i hodowanych na płytce Petriego. Po inkubacji płytkę delikatnie przemywa się, aby usunąć uRBC oraz niezwiązane iRBC. Do niewielkiej liczby iRBC przytwierdzonych do HBEC-5i dodaje się świeże uRBC i inkubuje przez noc. W momencie pękania pasożytów w stadium schizontów, merozoity ponownie infekują RBC; te pasożyty w stadium pierściankowym są zbierane następnego dnia. Pasożyty hoduje się do momentu uzyskania odpowiedniej ilości materiału (zazwyczaj od 2 do 4 tygodni), po czym można przeprowadzić kolejną rundę selekcji. W zależności od szczepu P. falciparum konieczne jest przeprowadzenie od 4 do 7 rund selekcji, aby uzyskać populację, w której większość pasożytów wiąże się z HBEC-5i. Fenotyp wiązania jest stopniowo tracony po kilku tygodniach, co wskazuje na zmianę w ekspresji genów wariantowych antygenów powierzchniowych, dlatego do utrzymania fenotypu wymagana jest regularna selekcja na HBEC-5i.

Podsumowując, opracowaliśmy test selekcyjny nadający pasożytom P. falciparum fenotyp bardziej „przylepny w przebiegu malarii mózgowej”. Byliśmy w stanie wyselekcjonować 3 z 4 szczepów P. falciparum na komórkach HBEC-5i. Test ten został również z sukcesem wykorzystany do selekcji pasożytów wiążących się z ludzkimi komórkami śródbłonka skóry i płuc. Co istotne, metoda ta może być stosowana do selekcji populacji pasożytów specyficznych tkankowo w celu zidentyfikowania potencjalnych ligandów pasożytów wiążących się ze śródbłonkiem mózgu. Ponadto test ten może służyć do przesiewowania potencjalnych leków przeciwdziałających sekwestracji7.

Protokół

Ogólne zalecenia

Kulturowanie ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu (HBEC-5i) zostało wcześniej opisane w 6, 8. Pasożyty P. falciparum hodowano zgodnie z opisem w 9. Zarówno hodowle HBEC-5i, jak i pasożytów P. falciparum powinny być przez cały czas utrzymywane w warunkach sterylnych. Wszystkie odczynniki należy uprzednio podgrzać do 37°C. Zalecamy regularne sprawdzanie obecności kontaminacji mykoplazmami10 za pomocą metody PCR (Minevera Biolabs, zgodnie z instrukcjami producenta). Protokół przedstawiono w skrócie na Ryc. 1.

1. Rutyniczna hodowla komórek śródbłonka

  1. Przygotuj niezbędne odczynniki.
Medium do przygotowania Odczynniki Ilość
"DMEM niepełny"DMEM-F12 Ham50ml
 L-glutamina 20mM5ml
 Penicylina/streptomycyna 10X5 ml
 NaOH 1M1.3 ml (dostosować pH do 7.4)
"DMEM pełny""DMEM niepełny"450ml
 Surowica płodowa wołową inaktywowana ciepłem50ml
 Suplement wzrostu komórek śródbłonka5 ml

  1. Hoduj komórki HBEC-5i w wentylowanej kolbie o powierzchni 25cm2 w 10ml kompletnej pożywki DMEM w inkubatorze przy 37°C i 5% CO2.
  2. Przeprowadzaj pasażowanie komórek po osiągnięciu pełnej konfluencji. Usuń starą pożywkę za pomocą odsysacza i przemyj dwukrotnie niekompletną pożywką DMEM lub PBS klasy kultur tkankowych (bez Ca2+ i Mg2+), uprzednio ogrzanym do 37°C.
  3. Dodaj 1ml uprzednio ogrzanego Trypsyny-EDTA (0,025% Trypsyny, 0,5mM EDTA), zamieszaj, aby pokryć całą powierzchnię kolby, i inkubuj przez ok. 2 min w 37°C.
  4. Sprawdź pod mikroskopem odwróconym, czy co najmniej 90% komórek oddzieliło się od podłoża. W razie potrzeby delikatnie uderz w dno kolby, aby odczepić przylegające komórki. Dodaj 10ml kompletnej pożywki DMEM w celu zablokowania działania trypsyny i przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 15ml. Centryfuguj przez 4 min przy 300 g w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 10ml kompletnej pożywki DMEM. Pipetuj roztwór w górę i w dół, aby dokładnie resuspenderć komórki.
  6. Przenieś 1 lub 2 ml zawiesiny komórkowej do nowej kolby hodowlanej i dodaj 8ml świeżej pożywki w celu podtrzymania hodowli. Codziennie oceniaj wzrost kultury pod mikroskopem odwróconym i wymieniaj pożywkę co 2 lub 3 dni, zanim zmieni ona kolor na żółty.

2. Przygotowanie komórek śródbłonka do selekcji

  1. Na dwa dni przed dniem selekcji, do jednej (lub więcej) szalki Petriego o średnicy 60 mm dodaj fibronektynę rozcieńczoną w sterylnym PBS (2 μg/cm2). Inkubuj szalkę przez 5 do 20 min w temperaturze 37°C, a następnie usuń roztwór fibronektyny, który można przechowywać w 4°C przez miesiąc i wykorzystać ponownie jeden raz.
  2. Wykonaj pasażowanie komórek zgodnie z opisem w sekcjach 1.3. do 1.5. Zakładając, że odłączone komórki przy 100% konfluencji zawieszono w 10 ml kompletnego medium DMEM (sekcja 1.6., w przypadku niższej konfluencji zawiesić w odpowiednio mniejszej objętości medium, np. w 8 ml, jeśli konfluencja wynosiła 80%), dodaj 1,5 ml zawiesiny komórkowej do szalki Petriego powlekanej fibronektyną oraz kolejne 1,5 ml kompletnego medium DMEM.
  3. Umieść zasianą szalkę Petriego w inkubatorze. Uwaga: Optymalnie konfluencja powinna wynosić około 90% w momencie selekcji dwa dni później.
  4. Opcjonalnie. Aby aktywować HBEC-5i, 24 godziny przed selekcją dodaj cytokinę TNF (Tumour Necrosis Factor) do końcowego stężenia 50μg/ml.

3. Rutynowa hodowla Plasmodium falciparum

  1. Przygotować niezbędne odczynniki (patrz tabela poniżej). Przygotować ludzkie erytrocyty (RBC), oddzielając je z krwi pełnej (grupa O+) poprzez przepuszczenie przez filtr do usuwania leukocytów (ogólne zasady hodowli pasożytów malarii opisano w publikacji „Methods in Malaria Research”11). Przemyć erytrocyty dwukrotnie, wirując przy 40 g przez 5 min i resuspendując je w 10 ml niepełnej pożywki RPMI. Przechowywać przemyte erytrocyty w temperaturze 4°C w pożywce niepełnej przy hematokrycie 50%.
Pożywka do przygotowaniaOdczynnikiIlość
"RPMI niepełna"RPMI 1640 (z wodorowęglanem)50ml
 Hepes 1M12.5ml
 Glukoza 20%5ml
 L-glutamina 200mM5ml
 Gentamycyna 50mg/ml250μl
 NaOH 1M0.7 ml (dostosować pH do 7.2)
"RPMI pełna""RPMI niepełna"450ml
 Pooled human (non-immune) serum50ml

  1. Hodować zakażone P. falciparum erytrocyty w pełnej pożywce RPMI przy 2% hematokrycie i inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 3% CO2, 1% O2 i 96% N2. Codziennie wykonywać rozmaz Giemsy1 w celu oceny stadium rozwoju pasożytów (Rysunek 2).
  2. Regularnie (około raz w tygodniu) synchronizować hodowlę poprzez traktowanie sorbitolem12. W dniu poprzedzającym test selekcyjny dążyć do uzyskania hodowli w stadium pierścienia przy parasitemii 5% lub wyższej (idealnie co najmniej 10%).

4. Selekcja P. falciparum pod kątem cytoadhezji do komórek śródbłonka

  1. W dniu przeprowadzenia analizy hodowla pasożytów powinna znajdować się w stadium pigmentowanych trofozoitów (Rysunek 2) (idealnie 10% parasitemii), natomiast hodowla HBEC-5i powinna osiągnąć od 50 do 100% konfluencji (idealnie 90%). Na każdą płytkę Petri z HBEC-5i wymagane jest 30μl objętości spakowanych komórek hodowli pasożytów.
  2. Przemyj pasożyty dwukrotnie, wirując (50g przez 5 min) 1,5ml hodowli pasożytów. Odlej nadosad i resuspenduj w 10ml świeżo przygotowanego, ogrzanego, niepełnego medium DMEM. Powtórz płukanie drugi raz. Resuspenduj 30μl objętości spakowanych komórek w 1,5ml niepełnego DMEM z 1% BSA.
  3. Przemyj powleczoną komórkami HBEC-5i płytkę Petri dwukrotnie, odsysając medium i dodając 3ml niepełnego DMEM.
  4. Dodaj zawiesinę pasożytów do płytki z HBEC-5i i inkubuj w 37°C przez 75min. Dwukrotnie resuspenduj pasożyty (po 30 i 60 min) podczas inkubacji, delikatnie kołysząc płytką w czterech kierunkach, a także zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
  5. Po inkubacji przemyj płytkę 5 razy poprzez odsysanie medium, dodawanie 3ml ciepłego niepełnego medium DMEM za pomocą plastikowej pipety Pasteura oraz delikatne kołysanie. W przypadku użycia wielu płytek, trzymaj je na ciepłej powierzchni, np. w dużej kolbie wypełnionej wodą o temperaturze 37°C.
  6. Sprawdź płytkę pod mikroskopem odwróconym. Jeśli wciąż widoczne są liczne niezakażone RBC, wykonaj dodatkowe płukania zgodnie z powyższym opisem. Operuj płytką Petri bardzo ostrożnie, aby uniknąć ryzyka kontaminacji.
  7. Usuń medium z płytki i dodaj 3ml ciepłego pełnego medium RPMI z 40μl objętości spakowanych komórek świeżych uRBC.
  8. Umieść płytkę w szczelnej komorze inkubacyjnej, przeprowadź gazowanie przez 3 min i umieść komorę w inkubatorze w 37°C na noc.
  9. Następnego dnia zbierz pasożyty, płukąc je niepełnym medium RPMI w sposób podobny do opisanego w sekcji 4.4, ale intensywniej. Całe zużyte medium (zawierające zresuspendowane RBC) przechowuj w probówce stożkowej 15ml. Sprawdź pod mikroskopem odwróconym, czy wszystkie RBC zostały usunięte z płytki.
  10. Odwiruj pasożyty, odlej nadosad, resuspenduj w 5ml pełnego medium RPMI i przelej mieszaninę do kolby do standardowego hodowania.

5. Reprezentatywne wyniki

Nieselekcjonowane pasożyty wykazują niski poziom wiązania do HBEC-5i (Rysunek 3A). W związku z tym, po pierwszej rundzie selekcji, zebrać zostanie bardzo mało pasożytów, a osiągnięcie parasytemii wystarczającej do drugiej rundy selekcji może wymagać nawet miesiąca hodowli. Po każdej rundzie selekcji coraz więcej pasożytów wiąże się z komórkami śródbłonka, co pozwala na powtarzanie selekcji w krótszych odstępach czasu. Po 4-5 rundach selekcji uzyskuje się populacje pasożytów o wysokim powinowactwie do wiązania (Rysunek 3).

W naszych badaniach wiązanie HB3-HBEC do HBEC-5i lub aktywowanych TNF HBEC-5i znajdowało się na podobnym poziomie (dane nie zostały przedstawione).

Opisany tutaj protokół został przetestowany na 4 szczepach P. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 oraz Dd2 (Tabela 1). Tylko ten ostatni okazał się niezdolny do wiązania się z HBEC-5i, nawet po 5 rundach selekcji.

Wyselekcjonowano również pasożyty HB3 pod kątem cytoadhezji do ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka skóry i płuc (HDMEC oraz HPMEC). Po 4 rundach selekcji, przy zastosowaniu opisanej tutaj metody, uzyskano populację o wysokim stopniu wiązania zarówno na HDMEC, jak i HPMEC (Rysunek 4).

Schemat selekcji pasożytów: inkubacja HBEC-5i, przemywanie, proces hodowli, czas zależny od stadium.
Rysunek 1. Przegląd procesu selekcji.

Etapy infekcji komórek krwi; obrazy mikroskopowe iRBC w stadium pierścienia oraz iRBC z pigmentowanymi trofozoitami.
Rysunek 2. Etapy rozwoju P. falciparum zakażone erytrocytyPreparat barwiony metodą Giemsy oglądany pod mikroskopem przy powiększeniu 10X.

Analiza wiązania pasożytów: obrazy mikroskopowe, wykres słupkowy; porównanie komórek HB3, wyniki doświadczalne.
Rycina 3. Typowy przykład wiązania się pasożytów z komórkami HBEC-5i(A) Niebieska warstwa to komórki HBEC-5i utrwalone glutaraldehydem i barwione metodą Giemsy, obrazowane pod mikroskopem przy powiększeniu 100X. Zdjęcia wykonano po wypłukaniu uRBC oraz nie związanych iRBC. Panel po lewej stronie przedstawia pojedynczą P. falciparum Pasożyt HB3 (nie wyselekcjonowany) związany z HBEC-5i. Na panelu prawym pasożyty HB3-HBEC były selekcjonowane przez 5 rund. (B) Dane przedstawiają średnią z dwóch niezależnych eksperymentów, z których każdy przeprowadzono w duplikacie. Policzono liczbę pasożytów związanych z jedną komórką śródbłonka.

Tabela selekcyjna dla HBEC-5i przedstawia liczbę rund niezbędnych dla HB3, IT/FCR3, 3D7 (Tak) oraz Dd2 (Nie).
Tabela 1. Podsumowanie Plasmodium falciparum szczepy, które zostały pomyślnie wyselekcjonowane pod kątem wiązania z HBEC-5i. Należy zauważyć, że HB3 był selekcjonowany również na aktywowanych TNF komórkach HBEC-5i. Po 5 rundach selekcji szczep Dd2 nie wykazał zwiększonego wiązania z HBEC-5i w porównaniu do nieselekcjonowanego szczepu Dd2.

Mikroskopia kultur komórkowych HDMEC i HPMEC przedstawiająca komórki HB3-Unselected oraz HB3-HBEC, jądra komórkowe zabarwione.
Rycina 4. Wiązanie P. falciparum pasożyty HB3 do komórek śródbłonka skóry (HDMEC) i płuc (HPMEC), przed i po 4 rundach selekcji. Choć pożywka hodowlana dla HDMEC i HPMEC nieznacznie się różni (patrz instrukcje dostawcy), protokół wykorzystany do selekcji był identyczny jak w przypadku HBEC-5i. Zdjęcia wykonane przy 40-krotnym powiększeniu.

Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyUwagi
DMEM-F12 Ham Sigma D6421 Do pełnej pożywki DMEM
L-glutamina 200mM GIBCO 25030 Do pełnych pożywek DMEM i RPMI
Penicylina/streptomycyna 10X (100 units/ml i 10mg/ml) ScienCell 0503 Do pełnej pożywki DMEM
Płóca wołowa (FBS) inaktywowana ciepłem ScienCell 025 Do pełnej pożywki DMEM
Trypsyna-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5mM EDTA) ScienCell 0103
Suplement wzrostu komórek śródbłonka ScienCell 1052 Do pełnej pożywki DMEM
Szalki Petriego 60 mm X 15 mm do hodowli tkankowych BD 35302
Ludzka fibronektyna Millipore FC010 Stosować w stężeniu 2 μg/cm2
TNF R&D Systems 210-TA opcjonalnie, stosować w stężeniu 50 μg/ml
RPMI 1640 Lonza BE12-167F Do pełnej pożywki RPMI
Gentamycyna 50mg/ml Lonza 17-518Z Do pełnej pożywki RPMI
Hepes 1M Lonza BE17-737E Do pełnej pożywki RPMI
HDMEC ScienCell 20 Pierwotna linia komórkowa
HPMECScienCell30Pierwotna linia komórkowa
HBEC-5i Otrzymano od Francisco Candal (fcandal@cdc.gov)

Tabela 2. Materiały

Dyskusja

Charakterystyczną cechą malarii mózgowej jest sekwestracja P. falciparum iRBC w obrębie mikrokrążenia mózgowego2, 3Jednakże, in vitro hodowle P. falciparum wykazują jedynie słabą cytoadhezję do HBEC-5i, modelu ludzkiego śródbłonka mikro naczyniowego mózgu. Opracowaliśmy prosty test umożliwiający wzbogacenie populacji pod kątem wiązania się z HBEC-5i, co pozwala na uzyskanie bardziejin vivo fenotyp podobny do [...]. Trzech z 4 P. falciparum Metodą tą pomyślnie wyselekcjonowano szczepy. Ponadto szczep HB3 wyselekcjonowano również na komórkach HDMEC i HPMEC, co wskazuje, że protokół ten może być stosowany dla różnych typów pasożytów i komórek śródbłonka.

Brak wiązania ze szczepem Dd2 można wyjaśnić za pomocą różnych hipotez. Najbardziej prawdopodobną jest fakt, że linia pasożyta ta jest pozbawiona guzków (knobless), co znacznie utrudnia cytoadherencję13, 14.

Zalecamy hodowlę nie wyselekcjonowanych pasożytów równolegle z procesem selekcji, aby zapewnić kontrolę do porównania. Pozwoli to na przykład na porównanie transkryptomu pasożytów wiążących i niewiążących, z nadzieją na odkrycie potencjalnych ligandów pasożytniczych.

TNF jest cytokiną występującą w wysokim stężeniu u pacjentów z malarią mózgową i wykazano, że indukuje ona ekspresję wielu białek powierzchniowych HBEC-5i (Claessens et al, w przygotowaniu oraz 8, 15, 16). W tym przypadku ilość związanych iRBC była podobna w normalnych komórkach HBEC-5i w porównaniu do aktywowanych komórek HBEC-5i.

Ten „model sekwestracji” może być również wykorzystany do badania oddziaływań molekularnych między iRBC a komórką śródbłonka, a także wpływu potencjalnych leków przeciwcytoadhezyjnych. W tym przypadku zaleca się wysiewanie HBEC-5i w mniejszych dołkach, takich jak „slajdy komorowe 8-dołkowe” (BD 354628) lub „CultureWell” (Sigma C7735-20EA).

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Francisco Candalowi z CDC Technology Transfer Office w Atlancie w Georgii za udostępnienie komórek HBEC-5i. Praca ta była finansowana przez Wellcome Trust (4-letni stypendium doktoranckie dla AC oraz Senior Fellowship in Basic Biomedical Science dla JAR, numer grantu 084226).

Bibliografia

  1. Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
  2. MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
  3. Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
  4. Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
  5. van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
  6. Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
  7. Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
  8. Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
  9. Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
  10. Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
  11. Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
  12. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  13. Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
  14. Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
  15. Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
  16. Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test cytoadhezjikom rki HBEC 5iselekcja paso yt wtest panowaniazainfekowane erytrocytystadium trofozoituanaliza mikroskopowahodowla kom rkowa

Powiązane artykuły