Artykuł metodologiczny

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

21.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3122

⸱

3 stycznia 2012

 , 
1Centre for Immunity, Infection and Evolution, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Streszczenie

Większość zgonów z powodu malarii u ludzi jest spowodowana pasożytami Plasmodium falciparum w stadium krwi. Malaria mózgowa, najgroźniejsze powikłanie tej choroby, charakteryzuje się gromadzeniem zakażonych Plasmodium falciparum czerwonych krwinek (iRBC) w stadium pigmentowanych trofozoitów w mikrokrążeniu mózgu2-4. Ta niedrożność mikronaczyniowa (sekwestracja) prowadzi do kwasicy, hipoksji i wydzielania szkodliwych cytokin zapalnych (przegląd w 5). Sekwestracja występuje również w większości tkanek mikrokrążenia w organizmie człowieka2, 3. Mechanizm, w którym iRBC przytwierdzają się do ścian naczyń krwionośnych, nie jest jeszcze dobrze poznany.

Unieśmiertelniona linia ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu (HBEC-5i) była wykorzystywana jako model in vitro bariery krew-mózg6. Jednakże iRBC Plasmodium falciparum słabo przylegają do komórek HBEC-5i in vitro, co różni się od gęstej sekwestracji występującej w przypadkach malarii mózgowej. Opracowaliśmy zatem test przeglądowy (panning assay) w celu selekcji (wzbogacenia) różnych szczepów P. falciparum pod kątem adhezji do HBEC-5i, aby uzyskać populacje pasożytów o wysokim stopniu wiązania, bardziej reprezentatywne dla zjawisk zachodzących in vivo.

Próbkę hodowli pasożytów (mieszaninę iRBC i niezinfekowanych RBC) w stadium pigmentowanych trofozoitów poddaje się przemywaniu, a następnie inkubuje na warstwie komórek HBEC-5i hodowanych na płytce Petriego. Po inkubacji płytkę delikatnie przemywa się, aby usunąć uRBC oraz niezwiązane iRBC. Do niewielkiej liczby iRBC przytwierdzonych do HBEC-5i dodaje się świeże uRBC i inkubuje przez noc. W momencie pękania pasożytów w stadium schizontów, merozoity ponownie infekują RBC; te pasożyty w stadium pierściankowym są zbierane następnego dnia. Pasożyty hoduje się do momentu uzyskania odpowiedniej ilości materiału (zazwyczaj od 2 do 4 tygodni), po czym można przeprowadzić kolejną rundę selekcji. W zależności od szczepu P. falciparum konieczne jest przeprowadzenie od 4 do 7 rund selekcji, aby uzyskać populację, w której większość pasożytów wiąże się z HBEC-5i. Fenotyp wiązania jest stopniowo tracony po kilku tygodniach, co wskazuje na zmianę w ekspresji genów wariantowych antygenów powierzchniowych, dlatego do utrzymania fenotypu wymagana jest regularna selekcja na HBEC-5i.

Podsumowując, opracowaliśmy test selekcyjny nadający pasożytom P. falciparum fenotyp bardziej „przylepny w przebiegu malarii mózgowej”. Byliśmy w stanie wyselekcjonować 3 z 4 szczepów P. falciparum na komórkach HBEC-5i. Test ten został również z sukcesem wykorzystany do selekcji pasożytów wiążących się z ludzkimi komórkami śródbłonka skóry i płuc. Co istotne, metoda ta może być stosowana do selekcji populacji pasożytów specyficznych tkankowo w celu zidentyfikowania potencjalnych ligandów pasożytów wiążących się ze śródbłonkiem mózgu. Ponadto test ten może służyć do przesiewowania potencjalnych leków przeciwdziałających sekwestracji7.

Protokół

Ogólne zalecenia

Kultura ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu (HBEC-5i) została wcześniej opisana w 6, 8. Pasożyty P. falciparum hodowano zgodnie z opisem w 9. Zarówno kultury HBEC-5i, jak i pasożytów P. falciparum powinny być przez cały czas utrzymywane w warunkach sterylnych. Wszystkie odczynniki należy uprzednio ogrzać do 37°C. Zaleca się regularne sprawdzanie obecności zanieczyszczeń mycoplasma10 za pomocą metody PCR (Minevera Biolabs, zgodnie z instrukcją producenta). Protokół został przedstawiony w schemacie na Rysunku 1.

1. Rutynowa hodowla komórek śródbłonka

  1. Przygotować niezbędne odczynniki.
Medium do przygotowania Odczynniki Ilość
"DMEM niepełny"DMEM-F12 Ham500ml
 L-glutamina 200mM5ml
 Penicylina/streptomycyna 100X5 ml
 NaOH 1M1,3 ml (dostosować pH do 7,4)
"DMEM pełny""DMEM niepełny"450ml
 Płodowa surowica bydlęca inaktywowana ciepłem50ml
 Suplement wzrostu komórek śródbłonkowych5 ml

  1. Kulturować HBEC-5i w wentylowanej kolbie o powierzchni 25cm2 w 10ml pełnej pożywki DMEM w inkubatorze przy 37°C i 5% CO2.
  2. Przesiewać komórki po osiągnięciu pełnej konfluencji. Usunąć starą pożywkę za pomocą odsysacza i przemyć dwukrotnie niepełną pożywką DMEM lub PBS do hodowli tkankowych (wolnym od Ca2+ i Mg2+) uprzednio ogrzanym do 37°C.
  3. Dodać 1ml ogrzanej Trypsyny-EDTA (0,025% Trypsyny, 0,5mM EDTA), delikatnie zamieszać, aby pokryć całe dno kolby, i inkubować przez ˜2 min w 37°C.
  4. Sprawdzić pod mikroskopem odwróconym, czy co najmniej 90% komórek oddzieliło się od podłoża. W razie potrzeby delikatnie opukać dno kolby, aby oderwać przylegające komórki. Dodać 10ml pełnej pożywki DMEM w celu zablokowania działania trypsyny i przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 15ml. Wirować przez 4 min przy 300 g w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Odlać nadsącz i resuspender osad w 10ml pełnej pożywki DMEM. Pipetować roztwór w górę i w dół, aby dokładnie resuspender komórki.
  6. Przenieść 1 lub 2 ml zawiesiny komórkowej do nowej kolby hodowlanej i dodać 8ml świeżej pożywki w celu utrzymania hodowli. Codziennie oceniać wzrost hodowli pod mikroskopem odwróconym i wymieniać pożywkę co 2 lub 3 dni, zanim zmieni kolor na żółty.

2. Przygotowanie komórek śródbłonka do selekcji

  1. Na dwa dni przed dniem selekcji, nanieś fibronektynę rozcieńczoną w sterylnym PBS (2 μg/cm2) do jednej (lub więcej) szalki Petriego o średnicy 60 mm. Inkubuj szalkę od 5 do 20 min w temperaturze 37°C, a następnie usuń roztwór fibronektyny, który można przechowywać w temperaturze 4°C przez miesiąc i wykorzystać ponownie raz.
  2. Przeprowadź pasażowanie komórek zgodnie z opisem w sekcjach 1.3. do 1.5. Zakładając, że komórki o 100% konfluencji zostały odczepione i resuspendowane w 10 ml kompletnego medium DMEM (sekcja 1.6., w przypadku niższej konfluencji resuspenduj w odpowiedniej objętości medium, np. w 8 ml, jeśli konfluencja wynosiła 80%), dodaj 1,5 ml zawiesiny komórek do szalki Petriego powlekanej fibronektyną oraz kolejne 1,5 ml kompletnego medium DMEM.
  3. Umieść wysianą szalkę Petriego w inkubatorze. Uwaga: Idealnie konfluencja powinna wynosić około 90% w momencie selekcji dwa dni później.
  4. Opcjonalnie. Aby aktywować HBEC-5i, dodaj cytokinę TNF (Tumour Necrosis Factor) w stężeniu końcowym 50μg/ml na 24 godziny przed selekcją.

3. Rutynowa hodowla Plasmodium falciparum

  1. Przygotować niezbędne odczynniki (patrz w poniższej tabeli). Przygotować ludzkie erytrocyty (RBC), oddzielając je z krwi pełnej (grupa O+) poprzez przepuszczenie przez filtr do usuwania leukocytów (szczegóły dotyczące ogólnej hodowli pasożytów malarii znajdują się w publikacji „Methods in Malaria Research”11). Erytrocyty przemyć dwukrotnie, wirując przez 5 min przy 400 g, a następnie resuspender w 10 ml niepełnego medium RPMI. Przemyte erytrocyty przechowywać w temperaturze 4°C w niepełnym medium przy hematokrycie 50%.
Medium do przygotowaniaOdczynnikiIlość
„RPMI niepełne”RPMI 1640 (z wodorowęglanami)500ml
 Hepes 1M12.5ml
 Glukoza 20%5ml
 L-glutamina 200mM5ml
 Gentamycyna 50mg/ml250μl
 NaOH 1M0.7 ml (dostosować pH do 7.2)
„RPMI pełne”„RPMI niepełne”450ml
 Łączone ludzkie serum (nieimmunologiczne)50ml

  1. Hodować zakażone P. falciparum erytrocyty w pełnej pożywce RPMI przy hematokrycie 2% i inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 3% CO2, 1% O2 oraz 96% N2. Codziennie wykonywać rozmaz Giemsy11 w celu oceny stopnia rozwoju pasożytów (Rysunek 2).
  2. Regularnie (około raz w tygodniu) synchronizować hodowlę poprzez traktowanie sorbitolem12. W dniu poprzedzającym test selekcyjny dążyć do uzyskania hodowli w stadium pierścieniowym przy parasitemii 5% lub wyższej (idealnie co najmniej 10%).

4. Selekcja P. falciparum pod kątem cytoadhezji do komórek śródbłonka

  1. W dniu przeprowadzania analizy hodowla pasożytów powinna znajdować się w stadium trofozoitów pigmentowanych (Rysunek 2) (idealnie 10% parasytemii), natomiast hodowla HBEC-5i powinna osiągnąć od 50 do 100% konfluencji (idealnie 90%). Na każdą szalkę Petriego z HBEC-5i wymagane jest 30μl objętości upakowanych komórek hodowli pasożytów.
  2. Przemyć pasożyty dwukrotnie, wirując (500g przez 5 min) 1,5ml hodowli pasożytów. Odlać supernatant i resuspender w 10ml świeżo przygotowanego, ogrzanego, niepełnego medium DMEM. Powtórzyć przemywanie po raz drugi. Resuspender 30μl objętości upakowanych komórek w 1,5ml niepełnego DMEM z dodatkiem 1% BSA.
  3. Przemyć powleczoną komórkami HBEC-5i szalkę Petriego dwukrotnie, odsysając medium i dodając 3ml niepełnego DMEM.
  4. Dodać zawiesinę pasożytów do szalki z HBEC-5i i inkubować w temperaturze 37°C przez 75min. Resuspender pasożyty dwukrotnie (po 30 i 60 min) podczas inkubacji, delikatnie kołysząc szalką w czterech kierunkach, a także zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
  5. Po inkubacji przemyć szalkę 5 razy, odsysając medium, dodając 3ml ciepłego niepełnego medium DMEM za pomocą plastikowej pipety Pasteura i delikatnie kołysząc. W przypadku użycia wielu szalek, należy trzymać je na ciepłej powierzchni, np. w dużym naczyniu wypełnionym wodą o temperaturze 37°C.
  6. Sprawdzić szalkę pod mikroskopem odwróconym. Jeśli wciąż widoczne są liczne niezakażone RBC, przeprowadzić dodatkowe przemycia zgodnie z opisem powyżej. Należy obchodzić się z szalką Petriego bardzo ostrożnie, aby uniknąć ryzyka kontaminacji.
  7. Usunąć medium z szalki i dodać 3ml ciepłego pełnego medium RPMI z 40μl objętości upakowanych świeżych uRBC.
  8. Umieścić szalkę w szczelnej komorze inkubacyjnej, napowietrzyć gazem przez 3 min i umieścić komorę w inkubatorze w temperaturze 37°C na noc.
  9. Następnego dnia zebrać pasożyty, przemywając je niepełnym medium RPMI w sposób podobny do opisanego w sekcji 4.4., ale bardziej intensywnie. Całe użyte medium (zawierające resuspenderowane RBC) zachować w stożkowej probówce 15ml. Sprawdzić pod mikroskopem odwróconym, czy wszystkie RBC zostały usunięte z szalki.
  10. Odwirować pasożyty, odlać supernatant, resuspender w 5ml pełnego medium RPMI i przenieść mieszaninę do kolby do standardowej hodowli.

5. Reprezentatywne wyniki

Niepoddane selekcji pasożyty wykazują niski poziom wiązania do HBEC-5i (Rysunek 3A). W związku z tym po pierwszej rundzie selekcji odzyska się bardzo niewielką liczbę pasożytów, a osiągnięcie poziomu parasytemii wystarczającego do drugiej rundy selekcji może wymagać nawet miesiąca hodowli. Po każdej rundzie selekcji coraz więcej pasożytów wiąże się z komórkami śródbłonka, co pozwala na powtarzanie selekcji w krótszych odstępach czasu. Po 4-5 rundach selekcji otrzymuje się populacje pasożytów o wysokim powinowactwie wiązania (Rysunek 3).

W naszych badaniach poziom wiązania HB3-HBEC do HBEC-5i lub aktywowanych TNF HBEC-5i był zbliżony (dane niepokazane).

Opisany tutaj protokół przetestowano na 4 szczepach P. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 i Dd2 (Tabela 1). Tylko ten ostatni okazał się niezdolny do wiązania się z HBEC-5i, nawet po 5 rundach selekcji.

Pasożyty HB3 zostały również poddane selekcji pod kątem cytoadhezji do ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka skóry i płuc (HDMEC i HPMEC). Po 4 rundach selekcji, z zastosowaniem opisanej tutaj metody, uzyskano populację o wysokim powinowactwie wiązania zarówno do HDMEC, jak i HPMEC (Rycina 4).

figure-protocol-1
Rycina 1. Przegląd procesu selekcji.

figure-protocol-2
Rycina 2. Stopnie rozwoju zakażonych P. falciparum erytrocytów. Rozmaz Giemsy wizualizowany pod mikroskopem przy powiększeniu 1000X.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Typowy przykład wiązania pasożytów do HBEC-5i. (A) Niebieska warstwa to HBEC-5i utrwalone glutaraldehydem i barwione Giemsą, wizualizowane pod mikroskopem przy powiększeniu 1000X. Zdjęcia wykonano po wypłukaniu uRBC i niewiążących iRBC. Lewy panel przedstawia pojedynczego pasożyta P. falciparum HB3 (niewyselekcjonowanego) związanego z HBEC-5i. W prawym panelu pasożyty HB3-HBEC były selekcjonowane przez 5 rund. (B) Dane przedstawiają średnią z dwóch niezależnych eksperymentów, z których każdy wykonano w dubletach. Policzono liczbę pasożytów związanych z jedną komórką śródbłonka.

figure-protocol-4
Tabela 1. Podsumowanie szczepów Plasmodium falciparum, które zostały pomyślnie wyselekcjonowane pod kątem wiązania z HBEC-5i. Uwaga: szczep HB3 został również wyselekcjonowany na komórkach HBEC-5i aktywowanych TNF. Po 5 rundach selekcji szczep Dd2 nie wykazał wzrostu wiązania z HBEC-5i w porównaniu do nieoselekcjonowanego szczepu Dd2.

figure-protocol-5
Rysunek 4. Wiązanie pasożytów P. falciparum HB3 z komórkami śródbłonka skóry (HDMEC) i płuc (HPMEC), przed i po 4 rundach selekcji. Chociaż pożywka hodowlana dla HDMEC i HPMEC nieco się różni (patrz instrukcje dostawcy), protokół zastosowany do selekcji był identyczny jak w przypadku HBEC-5i. Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 400X.

Nazwa odczynnikaFirmaNumer katalogowyUwagi
DMEM-F12 Ham Sigma D6421 Do pełnej pożywki DMEM
L-glutamina 200mM GIBCO 25030 Do pełnych pożywek DMEM i RPMI
Penicylina/streptomycyna 100X (10000 jednostek/ml i 10mg/ml) ScienCell 0503 Do pełnej pożywki DMEM
Płócka surowica bydlęca inaktywowana ciepłem ScienCell 0025 Do pełnej pożywki DMEM
Trypsyna-EDTA (0,025% trypsyny,   0,5mM EDTA) ScienCell 0103  
Suplement wzrostu komórek śródbłonka ScienCell 1052 Do pełnej pożywki DMEM
Szalki Petriego 60 mm X 15 mm traktowane do hodowli tkankowych BD 353002  
Ludzka fibronektyna Millipore FC010 Stosować w stężeniu 2 μg/cm2
TNF R&D Systems 210-TA opcjonalnie, stosować w stężeniu 50 μg/ml
RPMI 1640 Lonza BE12-167F Do pełnej pożywki RPMI
Gentamycyna 50mg/ml Lonza 17-518Z Do pełnej pożywki RPMI
Hepes 1M Lonza BE17-737E Do pełnej pożywki RPMI
HDMEC ScienCell 2000 Pierwotna linia komórkowa
HPMECScienCell3000Pierwotna linia komórkowa
HBEC-5i  Otrzymano od Francisco Candala (fcandal@cdc.gov)

Tabela 2. Materiały

Dyskusja

Charakterystyczną cechą malarii mózgowej jest sekwestracja P. falciparum iRBC w obrębie mikrokrążenia mózgowego2, 3Jednakże, in vitro hodowle P. falciparum wykazują jedynie słabą cytoadhezję do HBEC-5i, modelu ludzkiego śródbłonka mikro naczyniowego mózgu. Opracowaliśmy prosty test umożliwiający wzbogacenie populacji pod kątem wiązania się z HBEC-5i, co pozwala na uzyskanie bardziejin vivo fenotyp podobny do [...]. Trzech z 4 P. falciparum Metodą tą pomyślnie wyselekcjonowano szczepy. Ponadto szczep HB3 wyselekcjonowano również na komórkach HDMEC i HPMEC, co wskazuje, że protokół ten może być stosowany dla różnych typów pasożytów i komórek śródbłonka.

Brak wiązania ze szczepem Dd2 można wyjaśnić za pomocą różnych hipotez. Najbardziej prawdopodobną jest fakt, że linia pasożyta ta jest pozbawiona guzków (knobless), co znacznie utrudnia cytoadherencję13, 14.

Zalecamy hodowlę nie wyselekcjonowanych pasożytów równolegle z procesem selekcji, aby zapewnić kontrolę do porównania. Pozwoli to na przykład na porównanie transkryptomu pasożytów wiążących i niewiążących, z nadzieją na odkrycie potencjalnych ligandów pasożytniczych.

TNF jest cytokiną występującą w wysokim stężeniu u pacjentów z malarią mózgową i wykazano, że indukuje ona ekspresję wielu białek powierzchniowych HBEC-5i (Claessens et al, w przygotowaniu oraz 8, 15, 16). W tym przypadku ilość związanych iRBC była podobna w normalnych komórkach HBEC-5i w porównaniu do aktywowanych komórek HBEC-5i.

Ten „model sekwestracji” może być również wykorzystany do badania oddziaływań molekularnych między iRBC a komórką śródbłonka, a także wpływu potencjalnych leków przeciwcytoadhezyjnych. W tym przypadku zaleca się wysiewanie HBEC-5i w mniejszych dołkach, takich jak „slajdy komorowe 8-dołkowe” (BD 354628) lub „CultureWell” (Sigma C7735-20EA).

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Francisco Candalowi z CDC Technology Transfer Office w Atlancie w Georgii za udostępnienie komórek HBEC-5i. Praca ta była finansowana przez Wellcome Trust (4-letni stypendium doktoranckie dla AC oraz Senior Fellowship in Basic Biomedical Science dla JAR, numer grantu 084226).

Bibliografia

  1. Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
  2. MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
  3. Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
  4. Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
  5. van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
  6. Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
  7. Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
  8. Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
  9. Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
  10. Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
  11. Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
  12. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  13. Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
  14. Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
  15. Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
  16. Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test cytoadhezjikom rki HBEC 5iselekcja paso yt wtest panowaniazainfekowane erytrocytystadium trofozoituanaliza mikroskopowahodowla kom rkowa

Powiązane artykuły