$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie elektrod i do zapisów EEG/EMG
- Przygotować elektrodę rejestrującą EEG/EMG zgodnie z następującą procedurą.
nuta: Elektroda jest jednorazowa i może być używana tylko dla 1 zwierzęcia. Dokładnie zaplanuj konfigurację okablowania dla wszystkich złączy. Umieść znaczniki na złączach, aby uzyskać prawidłową orientację.
- każdy pin 4-pinowego złącza header do 2-centymetrowego drutu ze stali nierdzewnej. Krótko mówiąc, przytrzymaj jeden koniec drutu do kołka, umieść gorącą lutownicę na złączu drut-kołek i stopij trochę lutu, aby upewnić się, że wystarczająca ilość lutu płynnie wpada do złącza. Uważaj, aby nie przyłożyć zbyt dużo ciepła do szpilki; W przeciwnym razie plastik wokół kołków stopi się.
- wolny koniec każdego z 2 przewodów przymocowanych do listwy kołkowej do łba ze stali nierdzewnej o średnicy 1.0 mm. Krótko mówiąc, przytrzymaj wolny koniec drutu do gwintu poniżej łba, umieść gorącą lutownicę na złączu drut-śruba i stopij trochę lutu, aby upewnić się, że wystarczająca ilość lutu płynnie spływa do złącza. 2 przewody ze służą jako elektrody rejestrujące EEG, podczas gdy 2 przewody bez służą jako elektrody rejestrujące EMG.
- Użyj nożyczek, aby zdjąć 1 mm izolacji na końcu elektrod EMG, aby zwiększyć jakość sygnału EMG.
- Całkowicie pokryj wszystkie przylutowane piny klejem epoksydowym za pomocą cienkiego drewnianego patyczka lub wykałaczki, aby zredukować szum elektryczny podczas zapisów EEG/EMG.
- Przygotuj do połączenia elektrody z pierścieniem ślizgowym, jak opisano poniżej. Ten może być ponownie użyty.
- każdy pin 4-pinowego złącza FFC/FPC za pomocą przewodu płaskiego o długości 30 cm. Krótko mówiąc, przytrzymaj odizolowany koniec drutu do kołka, umieść gorącą lutownicę na złączu drut-kołek i stopij trochę lutu, aby upewnić się, że wystarczająca ilość lutu płynnie spływa do złącza.
Uwaga: Wybierz długość płaskiego, która jest odpowiednia do wysokości klatki dla zwierząt doświadczalnych używanej do zapisów EEG/EMG.
- gniazda zaciskane do końcówki przewodów na drugim końcu płaskiego. Krótko mówiąc, przyłóż gniazdo zaciskane do odizolowanego, wolnego końca drutu, umieść gorącą lutownicę na złączu drut-gniazdo i stopij trochę lutu, aby upewnić się, że wystarczająca ilość lutu płynnie wpada do złącza.
- Włóż każde gniazdo zaciskane do 4-pozycyjnej obudowy zaciskanej.
- Całkowicie przykryj gniazda zaciskane klejem epoksydowym za pomocą cienkiego drewnianego patyczka lub wykałaczki.
2. Implantacja elektrod w głowie myszy (Czas trwania: ok. 20 min)
- Przed zabiegiem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w gorącym sterylizatorze kulkowym. Znieczulić samca myszy (10-20 tygodni, 20-30 g) wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu (50 mg/kg). Po sprawdzeniu, czy mysz jest głęboko znieczulona przez uszczypnięcie palca u nogi, ogol włosy na głowie i szyi maszynką do strzyżenia.
- Przesuń mysz do ramki stereotaktycznej i zamocuj głowę między 2 listwami dousznymi. Nałóż wazelinę na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Oczyść ogoloną skórę alkoholem i przetnij ją skalpelem wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę. Przytnij skórę, aby pole operacyjne było otwarte.
- Za pomocą frezu z węglików spiekanych (rozmiar wiertła: średnica 0,8 mm) wywierć 2 otwory w czaszce, jeden nad czołowym obszarem kory mózgowej (1 mm przed bregmą, 1,5 mm bocznie do linii środkowej), a drugi nad obszarem ciemieniowym (1 mm przed lambdą, 1,5 mm od linii bocznej do środkowej) prawej półkuli, zgodnie ze współrzędnymi stereotaksycznymi Paxinosa i Franklina.
- Za pomocą śrubokręta jubilerskiego umieść rejestrujące EEG ze stali nierdzewnej w otworach i wykonaj 2 - 2,5 obrotu dla każdej, aby ustawić znieczulenie zewnątrzoponowe nad korą.
Uwaga: Nie wkładaj zbyt głęboko, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej. Sprawdź, czy są mocno dokręcone do czaszki. Jest to ważne, aby mieć stabilny sygnał EEG przez długi okres wielu zapisów (zwykle ponad 1 miesiąc). Wiggly wytwarzają artefakty EEG i mogą odpaść przed końcem harmonogramu eksperymentu.
- Przymocuj zespół elektrod (patrz rozdział 1.1, kołki skierowane do góry) za pomocą natychmiastowego kleju do czaszki i przykryj go cementem dentystycznym. Wykonaj obustronnie małe otwory kleszczami w mięśniach czworobocznych (szyi) i włóż do otworów druty ze stali nierdzewnej, które służą jako elektrody EMG. Zszyj skórę jedwabną nicią (o średnicy 0,1 mm), aby uniknąć odsłonięcia mięśnia.
- Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej. Ampicylinę (100 mg/kg) i meloksykam (1 mg/kg) należy podawać dootrzewnowo myszy, aby uniknąć zakażenia bakteryjnego i zmniejszyć ból pooperacyjny. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej i monitoruj ją, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Podczas rekonwalescencji należy trzymać mysz indywidualnie, aby uniknąć usunięcia elektrod przez inne zwierzęta i podawać meloksykam (1 mg/kg) dootrzewnowo w pierwszym dniu po operacji.
3. Rejestrowanie i pozyskiwanie danych EEG/EMG
- Po 1-tygodniowym okresie rekonwalescencji umieść każdą mysz indywidualnie w eksperymentalnej klatce umieszczonej w dźwiękoszczelnej komorze nagraniowej. Utrzymuj temperaturę otoczenia 23 ± 1 °C i automatycznie kontroluj cykle 12-godzinnego światła/12-godzinnej ciemności (światło włączone o godzinie 08:00, intensywność oświetlenia ~ 100 luksów).
- Podłącz zespół elektrod EEG/EMG na głowie myszy do nagrywającego. Upewnij się, że nagrywający jest podłączony do pierścienia ślizgowego (który jest zaprojektowany tak, aby ruchy myszy nie były ograniczane przez skręcanie) i wzmacniacza sygnału EEG/EMG. Filtr sygnałów EEG/EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizować z częstotliwością próbkowania 128 Hz za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego (A/D) i na koniec nagrywać na komputerze z oprogramowaniem do rejestracji EEG/EMG.
- Przyzwyczaj mysz do 2-3 dni w komorze nagrywającej.
- Następnie uruchom oprogramowanie do rejestracji EEG/EMG.
- Wybierz zakładkę "Informacje o pliku danych" i kliknij pole obok nazwy pliku. Wprowadź nazwę pliku i kliknij "Zapisz".
- Wybierz zakładkę "Warunek zapisu" i wybierz wszystkie kanały EEG/EMG, które będą rejestrowane.
- Wybierz częstotliwość próbkowania (128 Hz) w zakładce "Warunek nagrywania".
- Sprawdź, czy wybrane kanały są poprawnie wyświetlane w zakładce "Informacje o kanale".
- Wybierz zakładkę "Ustawienia timera" i kliknij "Monitor", aby wyświetlić EEG i EMG.
- Sprawdź, czy sygnały EEG/EMG są wyświetlane prawidłowo.
- Wybierz zakładkę "Ustawienia timera" i ustaw czas rozpoczęcia i zakończenia nagrania w obszarze "Główny timer".
- Kliknij "Monitor" w zakładce "Ustawienia timera", aby rozpocząć nagrywanie.
- Rejestruj sygnały EEG/EMG poniżej linii podstawowej (tj. zachowanie snu/czuwania swobodnie zachowującej się myszy). Poddać mysz eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu (200 mg/kg) po ostatnim dniu eksperymentalnym.