Testowanie funkcji nerwów czuciowych w chirurgicznie odnerwionym modelu myszy

Abstract

Źródło: Peterson, S. C. et al., Chirurgiczne odnerwienie skóry: metoda testowania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach chorób skóry. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje testowanie funkcji nerwu czuciowego w modelu mysim poprzez chirurgiczne odnerwienie jednej strony i pozostawienie drugiej jako kontroli. Reakcja na stymulację mechaniczną potwierdza rolę nerwów czuciowych.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Chirurgiczne odnerwienie

1. Roztwór znieczulający wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 200 μl na 20 g masy ciała myszy. Sprawdź, czy zwierzę osiągnęło właściwą płaszczyznę sedacji za pomocą testu szczypania palca u nogi i potwierdź, że częstość akcji serca i oddechów jest normalna (odpowiednio około 600 uderzeń i 160 oddechów na minutę).
2. Przygotuj obszar operacyjny skóry pleców za pomocą chusteczek Betadine i nasączonych alkoholem, a następnie przykryj zwierzę sterylną serwetą chirurgiczną (w celach demonstracyjnych pominięto sterylną zasłonę, aby zwiększyć widoczność). Utrzymuj zwierzę w cieple za pomocą poduszki grzewczej podczas operacji w aseptycznym obszarze operacyjnym.
3. Wykonaj nacięcie za pomocą sterylnego skalpela #11 wzdłuż grzbietowej linii środkowej od podstawy szyi do około 0,5 cm powyżej ogona.
4. Używając kleszczy, delikatnie odbij skórę po lewej stronie od boku, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę od poduszek tłuszczowych łopatki w pobliżu szyi do tuż nad kończyną tylną.
   nuta: Nerwy grzbietowo-skórne pojawiają się jako białe pasma, które przemieszczają się doogonowo przez półprzezroczystą powięź ściany tułowia, zanim wykonają ostre zagięcia i wejdą w luźną tkankę łączną pod skórą (ryc. 1).
5. Używając ultracienkich kleszczy pod mikroskopem świetlnym, usuń nerwy wyłącznie z lewej strony zwierzęcia znajdującego się w miejscach anatomicznych T3-12, wyrywając z miejsca, w którym segmenty zginają się przy ścianie tułowia, do miejsc ich wejścia w skórę (ryc. 1).
   1. Ustaw kleszcze pionowo i usuń nerwy, chwytając około 0,5 cm poniżej ich miejsc zgięcia i ciągnąc w górę, powodując rozciągnięcie nerwu i oddzielenie się od otaczającej tkanki (ryc. 1C-E). Uważaj, aby nie pęknąć sąsiednich naczyń krwionośnych.
   2. Kontynuuj, aż wszystkie nerwy rozciągające się od ściany tułowia do skóry zostaną usunięte. Nie zakłócaj nerwów w gęstej powięzi ściany tułowia. Utrzymuj tkankę wilgotną przez cały zabieg, okresowo aplikując krople sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej.
   3. Alternatywnie usuń nerwy, chwytając ich proksymalne końce w pobliżu ściany tułowia kleszczami i tnąc cienkimi nożyczkami. Następnie odetnij dystalne końce w pobliżu skóry (ryc. 1F-H). Na koniec usuń pośrednie segmenty nerwowe (ryc. 1I).
6. Usuń wszelkie nerwy z płata skóry odsłoniętego w kroku 1.4. Włókna te obejmują dystalne gałęzie grzbietowych nerwów skórnych i pojawiają się jako białe rozgałęzione pasma zlokalizowane sporadycznie w tkance łącznej po stronie skórnej płata skóry (ryc. 1J-K).
   1. Aby usunąć te drobne gałęzie, ustaw cienkie kleszcze mniej więcej równolegle do powierzchni skóry, chwyć nerwy i szarp w górę, aby uniknąć przerwania naczyń krwionośnych i przebicia skóry. Kontynuuj, aż wszystkie widoczne nerwy zostaną usunięte.
7. Używając rozwarstwienia, odbij skórę po prawej stronie nacięcia grzbietowej linii środkowej, ale nie usuwaj nerwów. Będzie to służyło jako kontralateralna kontrola sterowana pozorem.
8. Zszyj wzdłuż grzbietowej linii środkowej w prosty przerywany wzór, aby zamknąć nacięcie za pomocą nylonowych szwów 6-0, w prostym przerywanym wzorze oddalonym od siebie o około 3 mm.
9. Nie należy zwracać myszy, które przeszły operację, do tej samej klatki co inne zwierzęta, dopóki nie osiągną pełnej rekonwalescencji.
10. Monitoruj zwierzęta bezpośrednio po operacji, aż odzyskają przytomność, a także codziennie, aż obszar operacyjny się zagoi, zwykle w ciągu 1 tygodnia. Stosuj leki przeciwbólowe zgodnie z wyznaczonymi instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i stosuj, jeśli myszy wykazują oznaki bólu lub niepokoju. Zdejmij szwy w ciągu 7-10 dni po zabiegu. nuta: W razie potrzeby przygotować roztwór przeciwbólowy, rozcieńczając karprofen (50 mg/ml roztwór podstawowy) w stosunku 1:100 w sterylnej wodzie. Roztwór wstrzyknąć podskórnie między łopatki w pobliżu karku, w dawce 200 μl na 20 g masy ciała (5 mg/kg masy ciała myszy).
11. Aby funkcjonalnie ocenić stabilne odnerwienie do kilku tygodni po zabiegu, należy usunąć włosy ze skóry grzbietowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.
12. Delikatnie nakłuj odnerwiony obszar skóry za pomocą igły podskórnej i zwróć uwagę, czy zwierzę reaguje, zwykle drżąc lub odwracając głowę. Jeśli obszar skóry został stabilnie odnerwiony, zwierzę będzie wykazywać niewielką reakcję lub nie będzie jej wcale.

Results

Rysunek 1. Dwa podejścia do odnerwienia skóry grzbietowej. (A) Rysunkowy schemat unerwionej skóry myszy. Czerwone przerywane linie wskazują na pojedyncze wycięcie wykonane wzdłuż grzbietowej linii środkowej w celu odsłonięcia leżącej pod spodem mięśni na ścianie tułowia (fioletowy), a także skóry właściwej (szary, gwiazdka) pod odbitą skórą. Nerwy grzbietowo-skórne biegnące doogonowo wydają się "...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wkładki nasączone alkoholem	Pdi	Zobacz materiał B339
AnaSed (ksylazyna)	Lloyd	NADA 139-236
Podkładki przygotowawcze Betadine	Linia medline	MDS093917
Karprofen (Rimadyl)	Urządzenie Zoetis
Akumulatorowa maszynka do strzyżenia	Wahl	model trymera 8900
6-0 Szwy nylonowe	DemeTECH	NL166012F4P
Bardzo cienkie kleszcze	Dumont	0103-5-PO