Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola neuronalnego w ostrych wycinkach hipokampa

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Weng, W., et al. Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór typu recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje procedurę ustawiania wycinka mózgu w komorze zanurzeniowej w celu rejestrowania aktywności synaptycznej. Proces ten polega na zabezpieczeniu wycinka na papierze soczewki, utrzymaniu ciągłego przepływu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) w celu zapewnienia żywotności neuronów oraz dokładnym ustawieniu elektrod stymulacyjnych i rejestrujących względem określonego obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Taka konfiguracja pozwala na precyzyjne monitorowanie wyjściowej aktywności synaptycznej i efektów stymulacji elektrycznej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Rejestrowanie reakcji synaptycznych w komorze zanurzeniowej

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów.

  1. Podgrzej roztwór aCSF w łaźni wodnej do temperatury około 28-30 °C (zapobiegnie to tworzeniu się pęcherzyków w komorze nagrywającej).
  2. Uruchom system recyklingu (4-5 ml/min) i włącz grzałkę liniową, aby wyrównać działanie systemu przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Namocz na kilka minut mały kawałek papieru do czyszczenia soczewek i nylonową siatkę przymocowaną do platynowego drutu w kształcie litery U w komorze zanurzeniowej (Rysunek 1).
  4. Usuń platynowy drut w kształcie litery U.
  5. Wyłącz recykling i połóż plasterek na papierze do czyszczenia obiektywów.
  6. Natychmiast umieść siatkę przytrzymującą plasterek na wierzchu plastra, włącz pompę i pozwól plasterkowi zrównoważyć się przez 30 minut bez zanurzania obiektywu w aCSF.
  7. Napełnij mikropipetę borokrzemianową (tj. elektrodę rejestrującą) płynem CSF (rezystancja końcówki: 1-2 MΩ, napełniona w 1/3 aCSF) i umieść ją w uchwycie na pipety.
  8. Umieść testowaną elektrodę stymulacyjną wolframową z izolacją epoksydową w uchwycie manipulatora, a przewody odniesienia w komorze plastora.
  9. Dodać drugą elektrodę odniesienia do komory i podłączyć ją do gniazda odniesienia w stopniu czołowym elektrody rejestrującej (rysunek 1A).
  10. W oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem kliknij pole "tryb zerowego zacisku" i kontynuuj, klikając dwukrotnie pole "lista wzmocnień wyjściowych". Wybierz wzmocnienie "100", kliknij dwukrotnie "pole listy filtrów górnoprzepustowych (Bessel)", wybierz "0.1 Hz" i kliknij dwukrotnie "pole listy filtrów dolnoprzepustowych (AC)", aby wybrać "3 kHz".
  11. W oprogramowaniu do nagrywania kliknij przycisk "Acquire | Otwórz protokół." Wybierz protokół, który ma ustawienia pozwalające na stymulację epizodyczną i digitalizację wzmocnionych potencjałów przy 10-20 kHz przez 50-100 ms i który automatycznie uruchamia izolator bodźca 10 ms po rozpoczęciu nagrania epizodycznego.
  12. Umieść elektrody stymulacyjne i rejestrujące w linii i równolegle do warstwy piramidalnej, na przykład (Rysunek 1B i Rysunek 2).
  13. Kliknij "Zdobądź | Edytuj protokół" i wybierz zakładkę "wyzwalacz" (w wyskakującym okienku). Kliknij pole "źródło wyzwalaczy" i wybierz "spację" jako źródło wyzwalacza. Kliknij przycisk "OK". Kliknij przycisk "nagraj", aby rozpocząć akwizycję i zanotuj wyskakujące okienko z przyciskiem wyzwalającym.
  14. W oprogramowaniu izolatora bodźców kliknij pole "kontrola napięcia" i wprowadź "0". Kliknij przycisk "pobierz". Kliknij okno "oprogramowanie do nagrywania" i naciśnij spację. Powtórz ten cykl, wprowadzając sekwencyjnie wartości od 1 do 8, na przykład w krokach co 1 mV w polu "kontrola napięcia".
  15. Skoreluj siłę stymulacji z wartościami nachylenia fEPSP i określ siłę stymulacji wymaganą do uzyskania 40% maksymalnego nachylenia fEPSP. Kliknij "pole kontroli napięcia" i wprowadź określoną wartość. Kliknij przycisk "pobierz".
    nuta: Izolator bodźca służy do przykładania krótkich impulsów napięcia lub prądu do tkanki mózgowej. Impulsy dwufazowe mogą mieć 100 μs na fazę.
  16. W oprogramowaniu do nagrywania kliknij przycisk zatrzymania, a następnie menu "Pobierz". Kliknij "Edytuj protokół" i wybierz zakładkę "wyzwalacz" w wyskakującym okienku. Kliknij pole źródła wyzwalacza i wybierz "wewnętrzny zegar" jako źródło wyzwalacza. Kliknij przycisk "OK". Kliknij przycisk nagrywania, który rozpoczyna automatyczne rejestrowanie potencjałów pola na przykład co 30 s. Kliknij przycisk "stop" po 30-60 min.
  17. Kliknij menu "Pobierz", kliknij "Otwórz protokół", wybierz żądany protokół indukcji plastyczności synaptycznej i kliknij przycisk "OK". Kliknij przycisk "nagrywaj", aby automatycznie aktywować stymulację i nagrywanie wysokiej częstotliwości. Kliknij przycisk "zatrzymaj".
    nuta: W przypadku badań dotyczących plastyczności synaptycznej należy zastosować jeden ze standardowych paradygmatów indukcji dla długotrwałego wzmocnienia lub długotrwałej depresji po przedłużonym zapisie wyjściowym. Reprezentatywne przykłady wynikającej modulacji transmisji synaptycznej przedstawiono na rycinach 4 i 5.
  18. W oprogramowaniu do nagrywania kliknij "Acquire | Otwórz protokół" i wybierz ten sam protokół, co w kroku 4.12. Kliknij przycisk "OK", a następnie kliknij "nagraj". Kontynuuj automatyczne uruchamianie nagrań potencjału terenowego, na przykład przez 2-4 godziny. Kliknij przycisk "zatrzymaj", aby zakończyć nagrywanie.
  19. W przypadku badań farmaceutycznych należy nanieść związek bezpośrednio do zbiornika aCSF, jeśli pożądane jest stałe podawanie związku (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Składowe karbogenacji wypływowej do eksperymentów w komorze zanurzeniowej. (A) Prezentacja komory zanurzeniowej. Przedstawiony jest platynowy drut w kształcie litery U z włóknami nylonowymi trzymającymi plasterek hipokampa. Srebrne druty zostały owinięte wokół małej kaniuli, tworząc cewkę zwiększającą obszar zakończenia srebrnego drutu. Przewód odniesienia stymulacji umie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt i materiały do elektrofizjologii
Pionowy ściągacz do pipetNarishige, JaponiaKomputer PC-10
Stół wibroizolacyjnyMeirits, JaponiaADZ-A0806
Komora zapisowa typu zanurzonegoInstrumenty WarneraRC-26GLP
Termostatyczna łaźnia wodnaZhongcheng Yiqi, Chińska Republika LudowaHH-1
4-osiowy mikromanipulatorSutter, Stany Zjednoczone AmerykiZobacz materiał MP-285, MP-225
Drut platynowyŚwiatowe instrumenty precyzyjneZobacz materiał PTP406
wzmacniaczUrządzenia molekularne, Stany ZjednoczoneZacisk wielozaciskowy 700B
System Akwizycji DanychUrządzenia molekularne, Stany ZjednoczoneDigidata 1440A
Oprogramowanie analityczneUrządzenia molekularne, Stany ZjednoczoneClampex 10.2
Mikroskop fluorescencyjnyNikon, JaponiaFN1
Źródło światła LEDLumen Dynamics Group, KanadaX-cite 120LED
MikropipetyAparatura harwardzkaGC150TFNagrywanie pozakomórkowe
Mikropipety borokrzemianoweSutter, Stany Zjednoczone AmerykiZobacz materiał BF150-86zacisk krosowy
ElektrodaA-M Systems, Stany ZjednoczoneNumer katalogowy: 575500
Pompa perystaltycznaDłużej, ChinyZobacz materiał BT00-300T
Rurki do pompy perystaltycznejISMATEC, Wertheim, NiemcyZobacz materiał SC03091x dopływ, ID: 1,02mm
Rurki do pompy perystaltycznejISMATEC, Wertheim, NiemcyZobacz materiał SC03192x rurki odpływowe, ID: 2,79 mm
Kamera CCDPCO, Niemcypco.edge sCMOS
Papier do czyszczenia soczewekKodak
Stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 mlTermo naukowy339652
Komora wstępnaInstrumenty WarneraBSC-PC
Grzałka liniowaInstrumenty WarneraZobacz materiał SF-28
Regulator temperaturyInstrumenty WarneraTC-324B
Wymagane odczynniki
Zawartość NaClOdczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10019318
KclOdczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10016318
KH2PO4Odczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10017618
MgCl2·6H2OOdczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10012818
CaCl2Odczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10005861
NaHCO3Odczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10018960
glukozaOdczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10010518
NaH2PO4Odczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		20040718
HEPESY Sigma H3375
Pirogronian sodu Sigma Nr kat. A4043
MgSO4Odczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		20025118
NaOHOdczynnik chemiczny Sinopharm,
Chiny		10019718
powiedział: powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przekr j hipokampapolowe EPSPkomora zanurzeniowasztuczny p yn m zgowo rdzeniowyelektroda stymuluj caelektroda rejestruj carejestracja elektrofizjologicznatransmisja synaptycznapobudliwo neuronalnaprzygotowanie przekroju m zgu

Powiązane artykuły