Zapis elektroretinogramu z bezpośrednim sprzężeniem nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy

Streszczenie

Źródło: Miyagishima, K. J., et al. Bezpośrednio sprzężony elektroretinogram (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje nagranie bezpośrednio sprzężonego elektroretinogramu (DC-ERG) na przystosowanym do ciemności, znieczulonym nabłonku barwnikowym siatkówki myszy (RPE). Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w ustawieniu do nagrywania, a elektrodę kapilarną wypełnioną buforem solnym umieszcza się na rogówce. Po ustaleniu linii bazowej rejestruje się DC-ERG.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Pozycjonowanie myszy i elektrod

1. Trzymaj myszy na noc w dobrze wentylowanym, światłoszczelnym pudełku w celu adaptacji do ciemności.
2. Zwierzęta znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg).
3. Zastosuj miejscowo kroplę 0,5% proparakainy HCl, aby znieczulić rogówkę, a także kroplę 2,5% chlorowodorku fenylefryny i 0,5% tropikamidu, aby rozszerzyć źrenice.
4. Przytnij wąsy myszy nożyczkami, aby zapobiec przypadkowemu drgawkom, które mogłyby zakłócić szklane elektrody kapilarne podczas nagrywania.
   nuta: Protokół bodźca Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) w systemie ERG ma kilka wbudowanych procedur bodźców, które można wybrać, klikając Krok (strzałka do przodu) lub Krok (strzałka do tyłu). Tylko kroki 1, 4 i 5 w oprogramowaniu są wymagane do przygotowania i przeprowadzenia zapisu DC-ERG.
5. W systemie ERG oprogramowanie weryfikuje, czy został wybrany właściwy pacjent. Kliknij zielony przycisk Protokoły. W obszarze Protocol Description (Opis protokołu) wybierz pozycję DC-ERG. Następnie kliknij Uruchom. Sprawdź, czy jest to prawidłowy wykonywany test, klikając Tak.
6. Użyj bodźca czerwonego światła wyznaczonego w kroku 1/6, aby włączyć czerwone światło wewnątrz kopuły, aby pomóc ustawić mysz i elektrody podczas obserwacji zmian impedancji.
7. Umieść mysz na podgrzewanym stole do nagrywania i ostrożnie przykryj skórę tylnej nogi za pomocą kleszczy. Trzymaj elektrodę igłową mocno jedną ręką i włóż ją podskórnie do tylnej nogi, aby zamocować ją na miejscu.
8. Umieść referencyjną elektrodę srebra/chlorku siwa (Ag / AgCl) (tabela materiałów) w jamie ustnej tak, aby spiekana osadka spoczywała wzdłuż tylnego policzka i była utrzymywana na miejscu za zębami.
   nuta: Elektrody ze złotego drutu nie powinny być używane jako ustna elektroda odniesienia, ponieważ mają różne charakterystyki impedancji i zwiększają szum międzyszczytowy.
9. Przed umieszczeniem elektrod kapilarnych w oku myszy przytrzymaj uchwyt elektrody ze szklanymi kapilarnami pionowo i przesuń uchwyt elektrody palcem wskazującym, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły zostać wprowadzone. Napełnij końcówkę zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki i sprawdź, czy na końcówce nie ma pęcherzyków powietrza. Ustaw stojak uchwytu elektrody tak, aby otwarta końcówka naczyń włosowatych wypełnionych HBSS delikatnie stykała się z rogówką.
10. Stosuj specjalne środki ostrożności, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, trzymając dozownik żelu do oczu z lubrykantem odwróconym do góry dnem i wyrzucając początkowe krople. Umieść kroplę nawilżającego żelu pod oczy na każdym oku, aby utrzymać przewodność i zapobiec wysuszeniu podczas nagrywania.

2. Zapis DC-ERG

1. Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 4/6 "Długi błysk No-Li".
2. Kliknij Impedancja. Użyj ekranu sprawdzania impedancji, aby sprawdzić rezystancję lewego i prawego oka. Oczekuje się, że wartości impedancji dla elektrod rejestrujących przy każdym oku będą podobne (~39 kΩ). Oczekuje się, że wartości impedancji dla elektrod uziemienia i elektrody odniesienia będą mniejsze niż 10 kΩ).
3. Kliknij Podgląd, aby wyświetlić ślady dla lewego i prawego oka. Poczekaj, aż zostanie osiągnięty stabilny poziom bazowy (<10 min). Kliknij Zatrzymaj, aby wyjść z podglądu śledzenia.
   nuta: Nagłe zmiany kierunku dryftu lub nieprawidłowy szum w nagraniu nie poprawią się z czasem i będą wymagały zidentyfikowania elektrody kapilarnej, która wymaga uwagi. Najbardziej prawdopodobną przyczyną jest pęcherzyk wprowadzony do końcówki elektrody. Napełnij końcówkę HBSS. Kliknij ponownie Podgląd, aby sprawdzić linię bazową.
4. Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 5/6 "Długi błysk 10 cd 7 min". Kliknij Uruchom, aby rozpocząć nagrywanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Elektroda Ag/AgCl (ustna)	WPI Inc	EP1	Elektroda referencyjna do ust dla myszy
Dachówka ceramiczna	Instrument Suttera	Cts	Służy do przycinania szklanej rurki kapilarnej do odpowiedniego rozmiaru
Patyczek do czyszczenia z bawełnianą końcówką	Purytańskie produkty medyczne	867-WC Bez kleju	Do stosowania jako przekładka w celu poprawy dopasowania zespołu uchwytu elektrody
System elektroretinogramu (ERG)	Diagnosys Sp. z o.o	Układ E3	System elektrofizjologii wizualnej do diagnozowania schorzeń okulistycznych w badaniach wzroku i próbach leków
Palnik Bunsena	Technologie Argos	BW20002460	Lub równoważny do kształtu szkła pod płomieniem
Szklana rurka kapilarna (1,5 mm)	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał BF150-75	Do napełniania HBSS i nawiązywania kontaktu z rogówką
Bufor soli Hanka (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	Numer katalogowy: 14175-095	Dostępnych. Utrzymuj w RT
Filtr liniowy	Whatman	Nr kat. 6722-5001	Do ochrony pompy próżniowej przed aerozolami
o niskim poziomie szumów do uchwytów mikroelektrod	WPI Inc	5372	Sugerowane w celu poprawy długości i rozmieszczenia i zespołów uchwytów elektrod
Magnetyczny przegub kulowy	WPI Inc	500871	Do magnetycznego pozycjonowania zespołu uchwytu elektrody na stoliku
MatLab (Laboratorium Macierzyste	Matematyka		MatLab: Do edycji oprogramowania analitycznego
Zestaw narzędzi Matlab Curvefit	Matematyka		Toolbox dla MatLab (wymagany tylko do edycji oprogramowania analitycznego)
Kompilator MatLab	Matematyka		Toolbox dla MatLab (wymagany tylko do edycji i ponownego wydania oprogramowania analitycznego)
MatLab Runtime wersja 9.5	Matematyka	Czynnik chłodniczy R2018b (9,5)	Wymagane do uruchomienia oprogramowania analitycznego: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Uchwyty mikroelektrod (45 stopni)	WPI Inc	MEH345-15	Do podtrzymywania naczyń włosowatych
Igła (25 ga)	Wirus Covidien	8881250313	Do napełniania kapilar HBSS
elektroda igłowa (masowa)	Rytmlink	13mm - jedna elctroda	Podskórna elektroda igłowa (uziemiająca) dla myszy (igła o długości 13 mm, średnicy 0,4 mm, drut ołowiany 1,5 m)
Regulator/kondycjoner mocy	Furman	Zobacz materiał P-1800	Lub równoważne, aby usunąć przesunięcie prądu stałego z szumu wprowadzanego przez linię energetyczną
Strzykawka (12 ml)	Monojekt	1181200777	Do napełniania kapilar HBSS
Zacisk w kształcie litery T	Cole'a-Parmera	Numer katalogowy: 06852-20	Do montażu uchwytu elektrody
Eksykator próżniowy	Bel-Art	Numer telefonu 420120000	Przezroczyste dno i pokrywa z poliwęglanu
Leczenie farmakologiczne
Nawilżający żel pod oczy	Alcon	Numer katalogowy: 0078-0429-47	Pomaga nasmarować powierzchnię rogówki i utrzymać kontakt elektryczny z elektrodami kapilarnymi
Chlorowodorek fenylefryny 2,5%	Akorn powiedział:	Numer katalogowy: 17478-201-15	Krótko działające krople mydriackie do oczu (do rozszerzania źrenic)
Chlorowodorek proparakainy 0,5%	Akorn powiedział:	Nr kat. 17478-263-12	Znieczulenie miejscowe do wkraplania okulistycznego
Tropikamid 0,5%	Akorn powiedział:	Numer katalogowy: 17478-101-12	Krótko działające krople mydriackie do oczu (do rozszerzania źrenic)
Ksylazyna	AnaSed	sc-362949Rx	Środek przeciwbólowy i zwiotczający mięśnie
Zetamin (Ketamina HCl)	VetOne (VetOne)	501072	Środek znieczulający do wstrzyknięć domięśniowych

powiedział: . SZT. ) powiedział: