$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Chirurgia
UWAGA: Dokładne szczegóły operacji stymulacji w pętli zamkniętej zależą od rodzaju użytych sond rejestrujących i obszarów mózgu, które są celem ataku. Jednak w większości przypadków typowa operacja będzie składać się z następujących kroków.
- Przynieś klatkę ze szczurem na salę operacyjną w celu wszczepienia silikonowej sondy lub zestawu elektrod w celu rejestrowania aktywności neuronalnej.
- Znieczulij gryzonia 2-2,5% izofluranem i zamocuj głowę w ramie stereotaktycznej. Upewnij się, że zwierzę jest nieprzytomne podczas operacji, obserwując wszelkie reakcje motoryczne na łagodne bodźce dotykowe.
- Nałóż maść do oczu, aby zminimalizować suchość podczas zabiegu.
- Ogolić obszar operacyjny i zdezynfekować skórę 2% roztworem chlorheksydyny i 70% alkoholem izopropylowym.
- Lidokainę (5 mg/kg) należy wstrzyknąć pod skórę głowy w obszar mózgu, w którym zostaną wszczepione elektrody.
- Wykonaj nacięcie skóry głowy w obszarze przyszłego implantu i użyj skalpela i bawełnianego wacika, aby usunąć okostną z odsłoniętej czaszki.
- Wywierć 4-8 otworów w czaszce do wszczepienia kotwiących (~0,5 mm) jako podpory strukturalnej dla implantu. Przymocuj do czaszki, wkładając je w otwory i upewnij się, że są mocno trzymane na miejscu.
- Wywierć kraniotomię w określonych współrzędnych i włóż implant mikronapędu/sondy.
nuta: Opisany protokół stymulacji w pętli zamkniętej będzie działał w każdym obszarze mózgu, w którym zostaną umieszczone elektrody.
- Przymocuj mikronapęd/sondę i wszelkie wymagane złącza interfejsu elektrycznego do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego. Ilość akrylu dentystycznego powinna być wystarczająca do stabilnego przymocowania implantu, ale nie powinien on stykać się z otaczającymi tkankami miękkimi.
- Po operacji należy ściśle monitorować zwierzę, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Przez kolejne trzy dni należy podawać podskórnie lek przeciwbólowy (np. Metacam, 1 mg/kg) i antybiotyk zapobiegający zakażeniu (np. enrofloksacyna, 10 mg/kg).
nuta: Zwierzęta są zazwyczaj pozostawiane do rekonwalescencji po operacji przez tydzień przed jakimikolwiek badaniami lub nagraniem.
2. Instalacja oprogramowania
UWAGA: To zostało przetestowane na Windows 10, wersja 64-bitowa.
- Zainstaluj oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych.
- Zainstaluj system akwizycji danych Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), który zawiera biblioteki do interakcji z systemem pozyskiwania Cheetah.
- Zainstaluj SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) lub inne oprogramowanie, które używa KlustaKwik27 do sortowania wartości szczytowych. Oprogramowanie do wykrywania online korzysta z definicji klastrów z silnika KlustaKwik. To oprogramowanie może działać na tym samym komputerze lub na oddzielnych komputerach w tej samej sieci.
- Zainstaluj pakiet NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), który można również pobrać z https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
- Zainstaluj Matlaba (https://www.mathworks.com/downloads/; kod został przetestowany na Matlabie w wersji R2018a). Upewnij się, że Matlab jest włączony w zaporze systemu Windows. Zwykle podczas pierwszego połączenia pojawi się wyskakujące okienko.
- Zaloguj się na konto Matlab. Wybierz licencję. Wybierz wersję. Wybierz system operacyjny.
- Pobierz następującą bibliotekę do wyzwalania zdarzeń online z https://github.com/leomol/cheetah-interface i rozpakuj pliki do folderu "Dokumenty/Matlab" na komputerze. Kopia kodu znajduje się w dołączonych materiałach uzupełniających.
3. Początkowe pozyskiwanie danych
- Rozpocznij akwizycję danych za pomocą oprogramowania Cheetah.
- Nagraj kilka minut impulsowych danych, aby wypełnić przebiegi szablonu.
- Zatrzymaj pobieranie danych i wykonaj sortowanie wartości szczytowych zarejestrowanych danych.
- Otwórz SpikeSort3D, kliknij Plik | Zamknij menu | Załaduj plik Spike i wybierz plik spike z folderu z nagranymi danymi.
- Kliknij pozycję Menu klastra, a następnie pozycję Autocluster using KlustaKwik, pozostawiając ustawienia domyślne, a następnie kliknij przycisk Uruchom.
4. Eksperyment z zamkniętą pętlą
- Wznów zbieranie danych w Cheetah.
- Otwórz Matlaba.
- Otwórz ClosedLoop.m i kliknij Uruchom. Alternatywnie, w oknie poleceń Matlaba, wykonaj ClosedLoop(). Upewnij się, że plik ClosedLoop.m znajduje się w ścieżce Matlab. Jeśli użytkownik chce zastosować funkcję niestandardową do wywoływania każdego wyzwalacza, zamiast tego wykonaj ClosedLoop('-callback', customFunction), gdzie customFunction jest uchwytem tej funkcji.
- Załaduj informacje o spajkach zdefiniowane w początkowym nagraniu, klikając przycisk Załaduj, przeglądając folder nagrań i wybierając jeden z plików danych impulsowych (.ntt, .nse).
- Wybierz jeden lub wiele neuronów, które wyzwolą stymulację, klikając pole wyboru pod wykreślonymi przebiegami.
- Zdefiniuj minimalną liczbę neuronów, które wyzwolą stymulację, wpisując liczbę całkowitą w polu tekstowym "minimalna liczba dopasowań". Następnie zdefiniuj przedział czasowy, w którym skoki pasujące do różnych przebiegów są uważane za współaktywne, wpisując liczbę w polu tekstowym "okno".
- Kliknij przycisk Wyślij, aby rozpocząć. Spowoduje to rozpoczęcie wyzwalania zdarzeń online (domyślnie tonów) w oparciu o aktywność impulsową wybranych neuronów.