Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie eksperymentalnego roztworu i sprzętu do zapisu w matrycy wieloelektrodowej
- Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy [aCSF]; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH2PO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3 i 10 mM glukozy, pęcherzykowy z 95% O2 i 5% CO2 ).
- Użyj dwóch typów sond MEA: 6 x 10 płaskich MEA i 8 x 8 MEA. Pierwsza sonda obejmuje obszar obejmujący korę, prążkowie i wzgórze. Ta ostatnia sonda obejmuje tylko obszar korowy.
- Użyj 60-kanałowego wzmacniacza z filtrem pasmowo-przepustowym ustawionym w zakresie od 0,1 Hz do 3 kHz przy 1,200 amplifikacji. Pobieraj dane z częstotliwością próbkowania 10 kHz.
- Umieść dwa srebrne druty pokryte AgCl w komorze MEA dla DCS. Użyj srebrnych drutów pokrytych AgCl do wytworzenia pól elektrycznych, które są generowane przez izolowany stymulator.
- Umieść elektrodę wolframową (średnica, 127 μm; długość, 7,62 cm; końcówka stożkowa 8° AC; rezystancja, 5 MΩ) do stymulacji wzgórza i umieść elektrodę odniesienia w komorze MEA. Dostarczaj prądy elektrody wolframowej za pomocą izolowanego stymulatora, który jest sterowany przez generator impulsów.
2. Przygotowanie plastra mózgu
- Użyj samców myszy C57BL/6J w wieku 4-8 tygodni. Trzymanie zwierząt w klimatyzowanym pomieszczeniu (21-23 °C; 50% wilgotności; 12 godzin/12 godzin cyklu światła/ciemności, światło włącza się o 8:00) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody.
- Pobrać 250 ml porcji płynu CSF, który został przygotowany w kroku 1.1 i umieścić go w zlewce zawierającej lód. Jednocześnie dostarczaj ciągły gaz, który składa się w 95% zO2 i 5% CO2 .
- chirurgia
- Znieczulić zwierzę 4% izofluranem w szklanym pudełku przez około 3 minuty. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną głębokość znieczulenia (na co wskazuje brak reakcji na uszczypnięcie palca), umieść je na płytkiej tacy wypełnionej pokruszonym lodem i usuń głowę za pomocą nożyczek.
- Odsłoń czaszkę i odetnij pozostały mięsień. Następnie, za pomocą rongeurs, oderwij grzbietową powierzchnię czaszki od mózgu. Odetnij boki czaszki za pomocą rongeurs. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 75% roztworem etanolu.
- Za pomocą szpatułki przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu i usuń mózg. Po dekapitacji szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowato natlenionym aCSF.
- Przygotowanie MT-ACC Brain Slice
nuta: Przygotuj wycinki, które zawierają ścieżkę od MT do ACC.
- Ręcznie wytnij blok mózgu za pomocą dwóch strzałkowych nacięć 2,0 mm bocznych do linii środkowej w każdej półkuli, aby wyświetlić anatomię podkorową. Następnie wykonaj dwa cięcia pod kątem. Wykonaj pierwsze cięcie poprzeczne równolegle do widocznego przewodu światłowodowego w prążkowiu.
- Wykonaj drugi przekrój poprzeczny od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego między spoidłem przednim a drogami wzrokowymi, które są brzuszne i równoległe do szlaku wzgórzowego.
- Przymocuj blok mózgu do kątowej płytki (~120°) za pomocą kleju cyjanoakrylowego i wykonaj nacięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Rozłóż płytkę, spłaszcz ją i przyklej do stopnia komorowego wibratomu.
- Zrób przyśrodkowe plastry mózgu wzgórza-ACC (o grubości 500 μm), a następnie zanurz je w lodowato natlenionym aCSF. Przenieść plastry do komory rejestracyjnej i utrzymywać w temperaturze 32 °C pod ciągłą perfuzją (12 ml/min) z natlenionym aCSF przez 1 godzinę.
3. Przygotowanie komory perfuzyjnej do zapisu w matrycy wieloelektrodowej
- Przygotowanie komory perfuzyjnej
- Umieść sondę MEA w systemie wielokanałowym i użyj dwóch oddzielnych rurek polietylenowych, aby podłączyć sondę do pompy perystaltycznej. Użyj jednej rurki do wprowadzenia aCSF do komory MEA, a drugiej rurki do wyprowadzenia aCSF z komory. Na koniec należy w sposób ciągły perfekować preparat ciepłym (29-30 °C) natlenionym aCSF (8 ml/min).
- Przenieś wycinek mózgu do MEA. Przytrzymaj plasterek mózgu na MEA za pomocą mokrego bawełnianego wacika. Ostrożnie przesuń wycinek mózgu, aby upewnić się, że ACC jest zorientowany nad elektrodami.
- Użyj zestawów kotew do krojenia i przytrzymywania plasterków, aby docisnąć plasterek mózgu. Ten krok zapewnia dobre połączenie elektryczne między plastrem a elektrodami.
4. Generowanie pól elektrycznych przez DCS
Uwaga: Definicja orientacji pola elektrycznego opierała się na kierunku osi akkodendrytycznej w ACC. Orientacje komór dendrytowych i soma potwierdzono za pomocą barwienia metodą Golgiego.
- Umieść elektrodę AgCl (zdefiniowaną jako anodę) proksymalnie do ACC i umieść drugą elektrodę (zdefiniowaną jako katoda) dystalnie do ACC. Zapisz natężenie pola, które jest generowane przez dwie orientacje pola (równoległe i prostopadłe do włókien akkodendrytycznych ACC) przez MEA i dostarczaj prądy pól elektrycznych za pomocą stymulatora.
- Ustal odległość elektrod AgCl (około 1,5-2 cm) i dostosuj natężenie prądu stymulatora, aby DCS wynosił od 0,5 do 2 mA.
5. Elektrycznie indukowane korowe reakcje synaptyczne
Uwaga: Wywołanie reakcji synaptycznych w ACC poprzez stymulację elektryczną w MT, w której programowalny generator bodźców elektrycznych wytwarza prostokątne dwufazowe impulsy prądu.
- Powtórz sekcję 3 powyżej.
- Umieść elektrodę wolframową w MT i dostarczaj impulsy ze stymulatora do obszaru wzgórza plastrów za pomocą bipolarnych elektrod wolframowych.
- Użyj różnych natężeń prądu, aby określić próg, który wywołuje odpowiedź ACC. W tym przypadku użyj intensywności ±150 μA i czasu trwania 200 μs, co wywołało 80% maksymalną odpowiedź w ACC w większości plasterków.
- Przesunąć elektrodę wolframową wzdłuż szlaku wzgórza (od MT do ciała modzelowatego) w warstwie MT-ACC, aby uzyskać optymalne profile odpowiedzi.
- Wykonaj 10-20 przeciągnięć odpowiedzi ACC i użyj oprogramowania, aby automatycznie uśrednić wszystkie ACC wywołane stymulacją MT. Wynikiem są odpowiedzi synaptyczne w ACC indukowane przez stymulację MT przez szlak MT-ACC.
6. Elektrycznie wywołana aktywność podobna do napadu
Uwaga: Aktywność podobna do napadu została wywołana przez zastosowanie 4-aminopirydyny (4-AP; 250 μM) i bicukuliny (5 μM). Poprzednie badania kontrolne wykazały, że maksymalne i stabilne odpowiedzi pojawiły się 2-3 godziny po zastosowaniu leku.
- Powtórz sekcję 5 powyżej.
- Dodaj leki do roztworu perfuzyjnego. Użyj 4-AP (250 μM) i bicukuliny (5 μM). Równomiernie wymieszaj leki i kontynuuj perfuzję przez 2-3 godziny.
- Aby ułatwić aktywność podobną do napadów padaczkowych, utrzymuj pompę perfuzyjną na stosunkowo szybkim tempie perfuzji (8 ml/min), co może również pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się gradientu pH.
- Umieść elektrodę wolframową w MT i dostarcz stymulację elektryczną (150 μA, czas trwania 200 μs), aby uzyskać profile odpowiedzi ACC.
- Wykonaj 10-20 przeciągnięć i uśrednij odpowiedzi.
- Zastąp roztwór perfuzyjny świeżym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby wypłukać leki. Powtórz krok 6.5.
7. Testowanie wpływu DCS na wywołane reakcje korowe
- Powtórz sekcje 3 i 4. Upewnij się, że równomierne pola elektryczne są generowane przez przepuszczanie prądów między dwoma równoległymi srebrnymi drutami pokrytymi AgCl, które są umieszczone w komorze MEA. Jeśli nie ma żadnych problemów, DCS pozostaje w zakresie od 0,5 do 2 mA.
- Wyłącz DCS i umieść elektrodę wolframową, aby stymulować wzgórze (±150 μA, czas trwania 200 μs). Aby uzyskać maksymalne odpowiedzi synaptyczne w ACC, wykonaj 10-20 przemiatania i uśrednij odpowiedzi.
- Jednocześnie włącz DCS (siła DCS 2 mV/mm) i stymulację wzgórzową (350 μA, czas trwania 200 μs). Oceń zmiany amplitudy odpowiedzi ACC wywołanej stymulacją wzgórza podczas DCS.
- Wyłączyć DCS i dodać 4-AP (250 μM) i bicukulinę (5 μM) do roztworu perfuzyjnego. Następnie odczekaj 2-3 godziny. Kiedy leki wpływają na wycinek mózgu, wycinek wywołuje korowe reakcje napadowe.
- Wykonaj 10-20 przemiatania odpowiedzi ACC, a następnie zmierz amplitudę i czas trwania elektrycznych wywołanych reakcji napadowych kory
mózgowej.
- Po kroku 7.5 włącz jednocześnie DCS (siła DCS 2 mV/mm) i stymulację wzgórza (150 μA, czas trwania 200 μs). Oceń zmiany amplitudy i czasu trwania wywołanych reakcji napadowych kory mózgowej podczas aplikacji DCS.
- Zastąp roztwór perfuzyjny świeżym płynem płynu mózgowo-rdzeniowego w celu wypłukania leków i powtórz kroki 7.2 i 7.3.
- Zbierz wszystkie dane rejestracyjne i pogrupuj je w różne warunki eksperymentalne. Oceń amplitudę i czas trwania reakcji napadowych kory mózgowej w różnych warunkach eksperymentalnych.