Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie elektrody (Rysunek 1A-C)
UWAGA: Komputerowe loci pinów to po prostu styk bolcowy jako część interfejsu sygnałowego w urządzeniach komunikacyjnych. Składa się ze złącza męskiego, które podłącza się do złącza żeńskiego.
- Ostrożnie oddziel styki męskie i żeńskie od loci pinów komputera (rysunek 1A) za pomocą szczypiec. Połącz ze sobą styki męskie i żeńskie, aby utworzyć elektrodę i nałóż cyjanoakrylan, aby utworzyć mocne połączenie adhezyjne (rysunek 1C).
- Elektrody należy umieścić w zlewce wypełnionej wodą destylowaną i umieścić w myjce ultradźwiękowej na 10 minut. Przenieść je do suszarki w temperaturze 45 °C na 30 minut. Sterylizować elektrody światłem ultrafioletowym (UV) przez 30 minut.
2. Zabieg chirurgiczny (Rysunek 1D-F)
- Przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne i aparaturę stereotaktyczną. Znieczulić nowonarodzone szczenię szczura za pomocą znieczulenia izofluranem (2,5%) z powietrzem. Gdy szczenię jest głęboko znieczulone, należy dostosować dawkę izofluranu do 1,0%. Przed zabiegiem należy uszczypnąć ogon lub palec u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
- Zamocuj głowę szczeniaka w aparacie stereotaktycznym, umieszczając paski douszne w kanałach słuchowych i lekko je zaciskając.
nuta: Nie należy nadmiernie dokręcać nauszników, ponieważ czaszka noworodka jest bardzo miękka.
- Utrzymuj sterylne pole operacyjne, spryskując cały sprzęt 70% etanolem. Wykonaj 15-milimetrowe nacięcie na głowie za pomocą skalpela. Za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij skórę głowy od linii środkowej w czterech rogach. Umieść pod skórą trochę bawełny nasączonej solą fizjologiczną, aby nacięcie było szeroko otwarte (ryc. 1D).
- Znajdź punkty bregma i lambda na czaszce i zaznacz je ołówkiem. Użyj igły strzykawkowej (26 G), aby zrobić dwa otwory w korze przedczołowej (PFC) i hipokampie.
nuta: PFC znajduje się na poziomie +1,8 mm z tyłu do bregmy i -0,5 mm z boku do linii środkowej, podczas gdy hipokamp znajduje się na poziomie -2,0 mm przed bregmą i ±0,5 mm z boku do linii środkowej (ryc. 1D i E). Głębokość elektrody nie powinna być większa niż 2 mm poniżej powierzchni kory mózgowej, aby zminimalizować uszkodzenie mózgu.
- Użyj kleszczy do przytrzymania elektrod i włóż elektrody referencyjne i rejestrujące odpowiednio do PFC i hipokampa. Nałóż maść z erytromycyną wokół elektrody, aby uniknąć ewentualnej infekcji. Zamocuj elektrodę za pomocą cyjanoakrylanu.
- Przygotuj dentystyczny cement akrylowy tak, aby miał lepką i lepką konsystencję. Nałóż cement dentystyczny, aby pokryć elektrody i resztę czaszki.
nuta: Dokładnie osusz czaszkę przed nałożeniem cementu dentystycznego.
- Nałóż 5% kwasu pikrynowego na elektrody, aby je chronić.
nuta: Cała procedura powinna być wykonana w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne warunki.
- Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i wstrzyknij podskórnie 300 μl 10% glukozy. Połóż go na podgrzewanym kocu, aby się zregenerować. Upewnij się, że zwierzę jest ciepłe (37 °C) i porusza się w ruchu (tj. jest całkowicie wyleczone). Buprenorfinę podawać dootrzewnowo (0,05 mg/kg) w przypadku bólu pooperacyjnego.
nuta: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności (tj. normalnego zachowania i ruchu).
- Przywróć szczeniaka do jego domowej klatki z matką po odzyskaniu przytomności. Poczekaj dwa dni, aż zwierzę w pełni wyzdrowieje.
3. Zapis EEG
- Po pełnym wyzdrowieniu podłącz elektrody wszczepione na czaszce szczeniaka do wzmacniacza we własnej klatce. Podłącz amplifier do przetwornika analogowo-cyfrowego i podłącz konwerter do komputera; Przewody łączące należy traktować ostrożnie, aby się nie zaplątały.
- Wybierz częstotliwość próbkowania co najmniej 10 000 Hz w jednostce akwizycji danych do nagrywania (szerokość pasma nadajnika wynosi 1-100 Hz). Upewnij się, że dane są prawidłowo próbkowane.
- Po uzyskaniu zapisu wyjściowego należy wstrzyknąć młodemu dootrzewnowo kwas kainowy (KA, 2 mg/kg) w celu wywołania napadów padaczkowych. 15 minut po wstrzyknięciu KA należy obserwować i rejestrować wyładowania padaczkowe. Napady wywołane przez KA są zwykle fizyczne.
UWAGA: Czas trwania ictal-tonic wynosi około 15,2 ±0,9 s, czas trwania napadu wynosi około 62±5 s. Napadom drgawkowym u nowonarodzonych szczurów można zapobiec, podając IP we wstrzyknięciu hydratu chloralu (400 mg/kg).
- Zapisz zdigitalizowane dane i analizuj je za pomocą pakietów oprogramowania do przetwarzania sygnałów, takich jak spike2. Ujawnij poziom mocy różnych składowych częstotliwości w sygnale EEG noworodka, wykonując analizę widma mocy. Oblicz moc w ciągu 1 minuty, znajdując amplitudę średniej kwadratowej od 1 do 100 Hz (pasmo EEG).
