Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Streszczenie

Nabłonk de embrionalne ulegają złożonym deformacjom (np. zginaniu, skręcaniu, fałdowaniu i rozciąganiu), aby utworzyć pierwotne organy wczesnego zarodka. Śledzenie markerów fiducjalnych na powierzchniach tych arkuszy komórkowych jest uznaną metodą szacowania wielkości morfogenetycznych, takich jak wzrost, kurczenie się i ścinanie. Jednak nie wszystkie techniki znakowania powierzchni są łatwo dostosowalne do konwencjonalnych metod obrazowania i każda z nich posiada inne zalety oraz ograniczenia. W niniejszej pracy opisujemy dwie metody znakowania i ilustrujemy użyteczność każdej z nich. W pierwszej metodzie setki znaczników fluorescencyjnych są aplikowane jednocześnie do zarodka przy użyciu magnetycznych cząsteczek żelaza. Znaczniki te są następnie wykorzystywane do ilościowej oceny dwuwymiarowych (2-D) deformacji tkanki podczas morfogenezy. W drugiej metodzie mikrosfery polistyrenowe są wykorzystywane jako środki kontrastowe w nieinwazyjnym obrazowaniu metodą optycznej koherentnej tomografii (OCT) w celu śledzenia trójwymiarowych (3-D) deformacji tkanki. Techniki te zostały z sukcesem wdrożone w naszym laboratorium do badania fizycznych mechanizmów rozwoju wczesnego fałdu głownego, serca i mózgu i powinny być możliwe do dostosowania do szerokiego zakresu procesów morfogenetycznych.

Protokół

1. Ogólne przygotowanie eksperymentalne

1. Przygotuj pożywkę do hodowli tkankowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
   1. Rozcieńcz pożywkę Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (butelka 1 L z 4,5g/L glukozy, wodorowęglanem sodu i L-glutaminą). Dodaj 10 mL antybiotyków penicylina / streptomycyna / neomycyna.
   2. Pobierz 100 mL DMEM za pomocą sterylnej pipety transferowej i zastąp je 100 mL surowicy z kurczaka.
   3. Rozdziel DMEM/10% surowicy z kurczaka/1% antybiotyków do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 15 mL i zamroź.
2. Przygotuj roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) uzupełniony o wapń i magnez. Wymieszaj 100 mL 10X PBS, 900 mL wody dejonizowanej oraz 1 mL stężonego roztworu wapnia i magnezu (100 mg/mL CaCl₂•2H₂O, 100mg/mL MgCl₂•6H₂O).
3. Inkubuj jaja w orientacji podłużnej do pożądanego stopnia rozwoju zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona¹ (np. 23-25 godzin dla stadium HH5 lub 42-48 godzin dla stadiów HH11-12).
4. Wyjmij embriony z jaja, stosując metodę nośnika z papieru filtrowanego.
   1. Rozbij dno jaja o krawędź szalki Petriego o średnicy 150 mm. Odłam skorupkę od dołu i wlej zawartość jaja do szalki.
   2. Usuń z jaja gęste, lepkie białko za pomocą pęsety tępej.
   3. Wytnij z papieru filtrowanego Whatman nr 2 kółka o średnicy 2-3 cm. Używając dziurkacza jednootworowego, wykonaj otwory w środku papieru filtrowanego. Połóż jeden z pierścieni z papieru na żółtku w taki sposób, aby embrion był widoczny przez centralny otwór w pierścieniu.
   4. Wytnij wzdłuż zewnętrznej średnicy papieru filtrowanego za pomocą mikronarzędzi tnących. Usuń papier z żółtka za pomocą precyzyjnej pęsety.
   5. Delikatnie opłucz embrion w PBS, aby usunąć przylegające cząsteczki żółtka. (Embriony w stadium HH5 mogą wymagać namaczania przez 15-20 minut w celu usunięcia resztek żółtka). Wyjmij zestaw z papieru filtrowanego z kąpieli i połóż go stroną brzuszną do góry w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm. Połóż drugi pierścień z papieru filtrowanego na pierwszym, tak aby embrion znalazł się pomiędzy pierścieniami. Umieść metalowy pierścień wokół zewnętrznej strony „kanapki” z papieru filtrowanego (średnica ≈ 1,5 - 2 cm), aby zabezpieczyć embrion.
   6. Zanurz embrion w pożywce hodowlanej. Zweryfikuj poprawność morfologii i stadium embrionalne za pomocą mikroskopu w polu jasnym.
5. Użyj wyciągacza pipet do przygotowania szklanych igieł z cienką końcówką (średnica wewnętrzna 1,5 mm) (World Precision Instruments, Sarasota FL) do późniejszych sekcji tkanek i znakowania.

2. Znakowanie zarodków w stadium 5 HH barwnikiem DiI przy użyciu magnetycznych cząsteczek żelaza

1. Do niewielkiej ilości proszku żelaznego (żelazo zredukowane, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) w temperaturze pokojowej dodać kilka kropli nasyconego roztworu DiI w alkoholu i pozostawić do wyschnięcia. (Zwykle powoduje to zlepianie się cząsteczek po odparowaniu alkoholu). Za pomocą końcówki dociąganej mikropipety rozbić grudki cząsteczek żelaza, przenieść je do probówki do mikrocentryfugi, kilkakrotnie wypłukać i przykryć wodą dejonizowaną.
2. Aby oznakować komórki ektodermy w embrionie w stadium HH 5, umieścić pobrany embrion (tj. cały zestaw na papierze filtrowacyjnym) stroną grzbietową do góry w 35 mm szalce hodowlanej pokrytej obfitą warstwą pożywki i ustawić szalkę pod mikroskopem stereologicznym. Za pomocą szklanej igły usunąć błonę witelinową i odsłonić komórki ektodermy. (Należy uważać, aby nie przebić embrionu).
3. Nabrać kolumnę oznakowanych cząsteczek żelaza (w wodzie dejonizowanej) do pipety Pasteura. Korzystając z mikroskopu stereologicznego, zanurzyć końcówkę pipety pod powierzchnią cieczy i ustawić bezpośrednio nad embrionem. Powoli tocząc pipetę między palcami, wytrząsnąć cząsteczki z pipety i rozsypać je na embrionie.
4. Gdy embrion zostanie pokryty cząsteczkami, ostrożnie umieścić go w inkubatorze w temperaturze 37°C na około 10 minut. Wyjąć embrion z inkubatora i usunąć cząsteczki za pomocą silnego magnesu.
5. Użyć mikroskopu fluorescencyjnego z podłączoną kamerą wideo i odpowiednimi ustawieniami filtrów, aby uzyskać obrazy embrionu w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym, jak pokazano na rysunku 2A,B.
6. Ocenić gęstość oznakowania. Jeśli pożądane jest gęstsze rozmieszczenie, ponownie oznakować embrion dodatkowymi cząsteczkami (zgodnie z powyższym opisem) i odpowiednio wydłużyć czas inkubacji. Jeśli oznakowanie jest zbyt gęste, dodać niewielką ilość nieoznakowanych cząsteczek żelaza do probówki do mikrocentryfugi wypełnionej już oznakowanymi cząsteczkami i wymieszać zawartość probówki. Powtórzyć proces oznakowania na nowym embrionie i ponownie ocenić gęstość oznakowania.

3. Znakowanie mikro sfer polistyrenowych do obrazowania optycznej koherentnej tomografii (OCT) zarodków HH11-12

1. Przygotować w 35 mm szalce Petri roztwór czarnych mikrosfer o średnicy 10 μm (Polysciences Inc., Warrington, PA) w PBS. (Kuleczki powinny być na tyle duże, aby zapewnić kontrast w obrazowaniu OCT, ale jednocześnie na tyle małe, aby ich rozmiar był zbliżony do rozmiaru pojedynczych komórek. Konkretne wartości będą zależeć od rozdzielczości systemu OCT oraz badanych tkanek). Zazwyczaj wystarczy jedna kropla roztworu stokowego (2,6% ciał stałych-lateksu) na 1 mL PBS. Nabrać ten roztwór do strzykawki 10cc za pomocą igły o rozmiarze 22 G. Wymieszać roztwór w wortexie przez 30 sekund, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie kuleczek.
2. Uciąć pod kątem końcówki wyciągniętych igieł szklanych, używając talerza dysku twardego komputera². Średnica końcówki powinna być na tyle duża, aby kuleczki mogły przejść przez otwór, ale jednocześnie jak najmniejsza, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki podczas wstrzykiwania.
3. Napełnić ściętą igłę szklaną roztworem kuleczek za pomocą strzykawki. Delikatnie opukać mikropipetę, aby upewnić się, że roztwór dotarł do końcówki.
4. Za pomocą mikromanipulatora umieścić igłę szklaną w tym samym polu widzenia co embrion. Kuleczki powinny wypływać z końcówki pipety.
   1. Jeśli z mikropipety nie wypływają kuleczki, może to oznaczać zator. W takim przypadku powtórzyć kroki 3.2-3.4 z nową igłą szklaną.
   2. Jeśli zbyt wiele kuleczek przysłania pole widzenia, końcówka pipety może być zbyt szeroka. Powtórzyć kroki 3.2-3.4 z nową pipetą i nowym embrionem.
5. Wprowadzić końcówkę pipety do światła rurki mózgowej. Należy uważać, aby nie przebić brzusznej strony tkanki. Podczas wprowadzania kuleczek i cieczy do światła zaobserwowane zostanie przejściowe obrzęknięcie tkanki. Oznacza to poprawną intubację; należy wówczas szybko wycofać igłę szklaną.
6. Zweryfikować pod mikroskopem w świetle przechodzącym, czy w świetle rurki mózgowej znajduje się wystarczająca gęstość kuleczek. Pozostawić kuleczki do osadzenia się na 20 - 30 minut przed przejściem do sekcji 4.

4. Pozyskiwanie danych

* Poniższe metody dobrze nadają się do opisanej powyżej techniki znakowania fluorescencyjnego. Jednak w przypadku techniki znakowania mikrośferami, kuleczki mogą się odczepić podczas przenoszenia próbek między inkubatorami a systemami obrazowania. W takim przypadku najlepiej przejść bezpośrednio do kroku 4.2 (co pozwala całkowicie uniknąć przemieszczania/wstrząsania próbką). W obu metodach embriony są hodowane w pełnym zanurzeniu w płynnej pożywce hodowlanej. Jeśli embrion nie jest całkowicie zanurzony (co ma miejsce w niektórych konwencjonalnych technikach hodowli tkanek), geometria tkanki ulega znacznym zmianom z powodu nienaturalnie wysokiego napięcia powierzchniowego, a rozkłady odkształceń nie oddadzą dokładnie przebiegu normalnej morfogenezy 3-D^{3, 4}. Co więcej, zanurzenie tkanki zapobiega maskowaniu morfologii embrionu i współrzędnych markerów przez silny kontrast obserwowany na granicy fazy ciekłej i gazowej podczas obrazowania OCT.

1. Kultura zarodków (ogólna)
   1. Po uzyskaniu pierwszych obrazów (w świetle przechodzącym, fluorescencji lub OCT), umieść do siedmiu szalek hodowlanych 35 mm (z zarodkami) w szalce Petriego 150 mm i włóż cały zestaw do małej plastikowej torebki. Dodaj do torebki kilka kropli wody dejonizowanej w celu nawilżenia i napełnij torebkę mieszaniną 95% O₂ / 5% CO₂. Umieść zarodki w inkubatorze w temperaturze 37°C (Queue Stabiletherm, Asheville, NC) na wymagany czas aż do kolejnego punktu czasowego obrazowania. Stosując tę metodę, eksperymenty można przeprowadzić na wielu zarodkach tego samego dnia.
2. Kultura time-lapse (zautomatyzowana)
   1. Umieść oznakowane zarodki w szalce Delta T (średnica zewnętrzna 35 mm, otwór centralny 23 mm ze zwężającą się ścianką boczną, szkło o grubości 0,17 mm; Bioptechs, Butler, PA) zawierającej 1,2 mL pożywki hodowlanej.
   2. Przykryj szalkę szklaną pokrywką utrzymywaną w temperaturze 37°C za pomocą kontrolera szalek hodowlanych Bioptechs Delta T4 (aby zapobiec kondensacji). Przepływaj nad zarodkiem mieszaninę gazową 95% O₂ / 5% CO₂ dostarczaną przez urządzenie Mini-Pump Variable Flow (Fisher Scientific). Przed dotarciem do zarodka podgrzej i nawilż gaz, przepuszczając go przez wodę dejonizowaną na ciepłej (<100°C) płycie grzejnej. Schemat tego układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1.
   3. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby automatycznie pozyskiwało obrazy w określonych przez użytkownika odstępach czasu. W przypadku naszego mikroskopu fluorescencyjnego używamy oprogramowania Openlab (PerkinElmer, Waltham, MA), a w przypadku systemu OCT używamy oprogramowania swept source Thorlabs (Newton, NJ). Ponieważ ta metoda pozwala obecnie na przeprowadzenie tylko jednego eksperymentu time-lapse w danym czasie, najlepiej jest często pozostawić tego typu kultury na noc. Można obejść to ograniczenie, instalując zautomatyzowany stolik przesuwny kompatybilny zarówno z sprzętem, jak i oprogramowaniem systemu obrazowania⁵.

5. Reprezentatywne wyniki:

Etykiety są śledzone automatycznie (przy użyciu oprogramowania Volocity, PerkinElmer) lub ręcznie (przy użyciu wtyczki Manual Tracking w programie ImageJ, NIH) w każdym eksperymencie. W technice znakowania fluorescencyjnego stosujemy rutynę Matlab gridfit do dopasowania powierzchni 2D do współrzędnych markerów, co umożliwia obliczenie odkształceń powierzchni morfogenetycznych^{6, 7}. Do przekształcenia tych wartości w odpowiedni układ współrzędnych embrionalnych stosowane są standardowe równania. Alternatywnie, w technice OCT, powierzchnie są generowane z segmentowanych objętości obrazu (uzyskanych za pomocą standardowego oprogramowania, takiego jak Matlab lub Caret⁸), a odkształcenia mogą być obliczane w kierunku maksymalnego lub minimalnego zakrzywienia próbki⁹.

Wykorzystaliśmy naszą technikę z użyciem cząsteczek żelaza do znakowania i śledzenia ruchu komórek ektodermalnych podczas formowania się fałdu głowowego we wczesnym embrionie kurczaka. Jak pokazano na rysunku 2A, komórki znakowane fluorescencyjnie zostały rozmieszczone w całym embrionie. Obrazy embrionu w świetle przechodzącym i fluorescencyjne wykonano w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex ovo. Ruchy śledzonych znaczników (rys. 2B,C) posłużyły następnie do obliczenia ewoluujących rozkładów odkształceń morfogenetycznych podczas formowania się fałdu głowowego (rys. 2D-F).

Podobnie, nasza technika z użyciem polistyrenowych mikrosfer została wykorzystana do śledzenia ruchów tkanek na granicy śródmózgowia i tylnego mózgowia wczesnego zarodka kurczaka. Jak pokazano na rysunku 3 B-D, ruchy kulek śledzono przez 6 godzin, a na podstawie współrzędnych markerów obliczono odkształcenia charakteryzujące deformację tkanki w kierunkach podłużnym i obwodowym. Należy zauważyć, że metoda ta pozwala na analizę wyraźnych deformacji 3-D, ponieważ kuleczki mają tendencję do przylegania do wszystkich ścian wewnętrznego światła mózgu (rys. 3A).

Rycina 1. Schemat układu do hodowli tkankowej w technice time-lapse.

Rysunek 2. Ilościowe określanie dwuwymiarowych odkształceń tkanek we wczesnym zarodku kury z wykorzystaniem śledzonych znaczników fluorescencyjnych. (A) Zestawienie obrazu w jasnym polu i obrazu fluorescencyjnego zarodka w stadium HH 5 po usunięciu cząsteczek żelaza. Komórki ektodermalne znakowane DiI (czerwone) są rozmieszczone w całym zarodku. (B,C) Ruch znakowanych komórek śledzono przy użyciu programu ImageJ. Przesunięcia znaczników obliczono w układzie współrzędnych zarodka (X,Y). Należy zauważyć, że A i B to ten sam obraz. (D-F) Wykresy konturowe ewoluujących rozkładów odkształceń wzdłużnych podczas formowania się fałdu głowy. Lagrangianowskie odkształcenia wzdłużne obliczono względem stadium HH 5 (tj. A i B) po (D) 75 min, (E) 120 min i (F) 165 min inkubacji. Odkształcenia te charakteryzują zmiany długości elementów liniowych pierwotnie zorientowanych wzdłuż osi Y (w zarodku w stadium 5). Dalsze szczegóły dotyczące wykorzystania współrzędnych śledzonych znaczników do obliczania odkształceń morfogenetycznych znajdują się w pracach Filas et al. (2007)⁶ oraz Varner et al. (2010)⁷. Należy zauważyć, że C i F to ten sam obraz. Pasek skali = 500 μm.

Rycina 3. Ilościowe określanie trójwymiarowych deformacji tkanek w wczesnym mózgu kurczaka. (A) Polistyrenowe mikrosfery przylegające do strony grzbietowej (czarna strzałka) i brzusznej (biała strzałka) rurki mózgowej są łatwo rozróżnialne od tkanek otaczających w przekroju poprzecznym. Widoki brzuszne rekonstrukcji OCT pokazują położenie mikrosfer w pobliżu granicy śródmózwia i rombencefalonu w stadium (B) HH12 oraz po (C) 6 h inkubacji (M: śródmózwie, H: rombencefalon). Zaznaczono kilka grup kulek, aby wyróżnić ogólną deformację tkanki. (D) Obliczono podłużne (E_zz) i obwodowe (E_θθ) odkształcenia Lagrange'a na podstawie tych deformacji. Dodatnie odkształcenia podłużne i ujemne obwodowe na granicy śródmózwia i rombencefalonu odzwierciedlają osiowe wydłużenie i obwodowe skrócenie tego regionu podczas hodowli. Dalsze szczegóły dotyczące obliczania odkształceń morfogenetycznych dla złożonych powierzchni podczas morfogenezy znajdują się w pracy Filas et al. (2008)⁹. Pasek skali = 200 μm.

Dyskusja

Przedstawiono dwie techniki znakowania tkanek dla hodowli ex ovo wczesnych embrionów kurzych. Pierwsza z nich wykorzystuje fluorescencyjne barwniki lipofilowe dostarczane za pomocą magnetycznych cząstek żelaza w celu jednoczesnego znakowania setek komórek. Metoda ta nie jest jednak obecnie kompatybilna z optyczną tomografią koherencyjną, ponieważ barwniki fluorescencyjne wykazują zazwyczaj niewielki kontrast względem otaczających tkanek w badaniu OCT¹⁰. Przedstawiono zatem alternatywną technikę z wyko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM — wysoka zawartość glukozy	Sigma-Aldrich	D5796
Penicylina/Streptomycyna/Neomycyna	Sigma-Aldrich	P4083
Surowica kurzyka	Invitrogen	16110-082
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D1408	10X
Papier filtracyjny Whatman #2	Whatman, GE Healthcare	1002 090	średnica 90mm
Szklane mikropipety	World Precision Instruments, Inc.	TW150-6	średnica wewnętrzna 1.5mm
DiI	Invitrogen	D-282
Żelazo zredukowane	Mallinckrodt Baker Inc.	5320
Mikrosfery o średnicy 10 μm (czarne)	Polysciences, Inc.	24294
Szalka Delta T (do hodowli w trybie time-lapse)	Bioptechs	04200415B	grubość 0.17mm, czarna
Kontroler szalek hodowlanych Delta T4	Bioptechs	0420-4-03
Minipompa o zmiennym przepływie	Fisher Scientific