Ocena interakcji neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka w kokulturze

Streszczenie

Źródło: Fuchs, Q. et al., Współhodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka wysokiego stopnia w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny oddziaływań elektrycznych. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje ocenę aktywności elektrycznej neuronów w kokulturze pochodzących z hiPSC korowych neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego z układami wieloelektrodowymi.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbki zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Protokół wspólnej hodowli

1. Dostosuj dzień wysiewu i stężenie dla linii komórkowych UW479 i BT35, aby osiągnąć 80% zlewających się komórek, gdy powinna rozpocząć się kohodowla, co odpowiada 21 dniom hodowli dla neuronów glutaminergicznym.
2. Trypsynizuj komórki UW479 i BT35 i rozsiewaj je na wierzchu neuronów glutaminergicznego w każdym dedykowanym urządzeniu mikroprzepływowym (o docelowej gęstości 900 komórek/^mm2 dla każdego typu komórki) przed wysiewem komórek glejaka pediatrycznego o wysokim stopniu złośliwości (pHGG) do urządzenia mikroprzepływowego zawierającego dojrzałe neurony glutaminergiczne.
3. Utrzymuj kokultury przez 2 dni w kontrolowanym środowisku (37 °C, 5% CO₂) z neuronem glutaminergicznym Day11 i dalszym podłożem wyszczególnionym w Tabeli 1.
4. Policz komórki pHGG za pomocą zdjęć mikroskopowych analizowanych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, aby ocenić ich żywotność. Obliczanie procentu komórek.
   UWAGA: Użyj następującego wzoru: 100 - ((liczba komórek w D23 / liczba komórek w D21) x 100).

2. Zapis elektrofizjologiczny

1. Zapis elektrofizjologiczny należy wykonać za pomocą komercyjnego systemu i dostępnego na rynku oprogramowania.
   nuta: Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu układu wieloelektrodowego (MEA), który składał się z elektrod o średnicy 30 μm rozmieszczonych w odstępach co 100 μm.
2. Wykonaj pierwszy zapis elektrofizjologiczny neuronów glutaminergicznego w D21 przed wysiewem komórek pHGG. Użyj zróżnicowanych neuronów glutaminergicznego jako kontroli i hoduj je samodzielnie równolegle do kokultury. Wykonaj drugie nagranie dla obu warunków zgodnie z opisem w następnym kroku o numerze 3.
3. Wykonaj drugi zapis elektrofizjologiczny w D23 (po 2 dniach kohodowli).

Tabela 1: Skład pożywki hodowlanej dla neuronów glutaminergicznym pochodzących z hiPS.

powiedział:

Składniki	Podłoże siewne	D4 średni	D7 średni	D11 i dalsze podłoże
DMEM/F-12 Średni	0,5 razy	0,25 razy	0,125x	Ø
Podłoże nerwowo-podstawowe	0,5 razy	0,25 razy	0,125x	Ø
BrainPhys Średni	Ø	0,5 razy	0,75x	1x
Suplement SM1	1x	1x	1x	1x
N2 Suplement-A	1x	1x	1x	1x
Ala-GLN (GlutaMax)	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM
BDNF powiedział:	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml
Certyfikat GDNF	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml
TGF-β1	1 ng/ml	1 ng/ml	1 ng/ml	1 ng/ml
Geltrex	30 μg/ml	Ø	Ø	Ø
Suplement do nasion	1x	Ø	Ø	Ø
Dzień 4 Suplement	Ø	1x	Ø	Ø

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
256MEA100/30iR-ITO-bez	Mcs	256MEA100/30iR-ITO-bez
Sonda 40 μm do licznika Scepter	Holender	Numer katalogowy: 53750
Sonda 60 μm do licznika Scepter	Holender	Numer katalogowy 51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	Kontroler G8541
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II	Thermo Scientific	HERASafe typu KS12
Korowe neurony glutaminergiczne	Mózg Xell	BX-0300
DMEM/F12 Średni	Sigma	Zobacz materiał D8437
Procesor DPBS 1X	Holender	L0615-500
Kolby do hodowli komórkowych EasYFlaskTM 75cm3	Nunc	156499
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Holender	500105
Certyfikat GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Technologie życiowe	A1413201
Ludzki BDNF	Peprotech	Rozdział 450-02
inkubator	Memmert	IC0150med
MEA2100	Mcs	Numer katalogowy: 181205-MEA2100-11240
Mikropipeta P10	Sartorius Sartorius (Wyspa	LH-729020
Mikropipeta P100	Sartorius Sartorius (Wyspa	LH-729050
Mikropipeta P1000	Sartorius Sartorius (Wyspa	LH-729070
Mikropipeta P200	Sartorius Sartorius (Wyspa	LH-729060
Mikroprobówka Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Holender	Numer katalogowy: 33290
Eksperymentator wielokanałowy	Mcs	-
N2 Suplement-A	Komórka macierzysta	Zobacz materiał 7152
Podłoże nerwowo-podstawowe	Technologie życiowe	21103049
Suplement neuronalny Neurocult SM1	Komórka macierzysta	Numer katalogowy: 5711
Aminokwasy endogenne (NEAA) bez L-glutaminy	Holender	Zobacz materiał X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipeta do hodowli komórkowych 10 ml Falcon®	Holender	357551
Pipeta do hodowli komórkowych 5 ml Falcon®	Holender	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart powiedział:	370151000
Poli-D-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P6407
Mikroskop Primoverta	Zeiss	Numer telefonu 415510-1100-000

powiedział: powiedział: szt. powiedział: Sar Sar Sar Sar TGL TGL