Wszczepianie układu elektrod i światłowodu do hipokampa myszy

Streszczenie

Źródło: Bender, F., et al., Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje stereotaktyczne wszczepienie drutu elektrodowego i światłowodu w hipokampie modelu myszy.

Protokół

Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie światłowodów (Rysunek 1A)

1. Stosować światłowód wielomodowy (rdzeń 105 μm, pokryty szkłem z rdzeniem krzemionkowym, 0,22 NA). Zdejmij powłokę 125 μm z rdzenia włókna za pomocą mikrościągacza, gdy włókno jest nadal przymocowane do szpuli włókna.
2. Przytnij włókno na długość około 2-3 cm za pomocą noża diamentowego.
3. Włóż włókno do ceramicznej skuwki w sztyfcie z tlenku cyrkonu (ID: 126 μm). Około 0,5-1 mm światłowodu powinno wystawać z wypukłej strony tulejki.
4. Za pomocą igły nałóż jedną kroplę kleju epoksydowego na oba końce skuwki, ale nie na boki skuwki. Alternatywnie użyj super kleju.
5. Pozostaw klej do wyschnięcia na co najmniej 30 minut.
6. Wypukłą stronę skuwki wypoleruj za pomocą diamentowej folii polerskiej z włókna docierającego (ziarnistość 3 μm).
7. Przetestuj wierność transferu światła za pomocą miernika mocy optycznej.
   1. Ustaw długość fali na mierniku mocy na tę samą długość fali, co używany laser.
   2. Umieść krosowy tak, aby końcówka była skierowana do środka czujnika. Włącz laser i odczytaj strumień świetlny z miernika mocy. Zapisz wartość.
   3. Podłącz światłowód do krosowego za pomocą pasującej tulei i ustaw go tak, aby końcówka światłowodu była skierowana do środka czujnika. Włącz laser i odczytaj strumień świetlny z miernika mocy. Zapisz wartość.
   4. Oblicz szybkość transmisji, dzieląc drugą wartość przez pierwszą wartość. Jeśli szybkość transmisji jest niższa niż 0,5, wyrzuć światłowód; W przeciwnym razie użyj go do implantacji.
   5. Przetestuj szybkość transmisji dla każdego włókna przed implantacją.
   6. W przypadku późniejszych eksperymentów dostosuj natężenie światła lasera do szybkości transmisji światłowodu: Ustaw strumień świetlny z końcówki krosowego na 5-15 podzielony przez szybkość transmisji, aby uzyskać ostateczną moc światła z końcówki światłowodu 5-15 mW.

2. Przygotowanie układów drutu wolframowego do nagrań LFP (Rysunek 1B)

1. Przyklej kilka (na przykład 6) prowadnic rurki krzemionkowej o grubości 100 μm równolegle do lepkiej strony kawałka taśmy. Wytnij jeden kawałek, około 4-6 mm, na jeden zespół przewodów.
2. Przez rurki prowadzące przewleczone są izolowane formvarem druty wolframowe 45 μm za pomocą kleszczy.
3. Zdejmij sześć izolowanych emalią cienkich miedzianych drutów łączących (o długości około 5 mm) i przewód uziemiający (o długości około 2-3 cm) za pomocą skalpela, aby zeskrobać izolację na obu końcach. je do pinów nanozłącza.
4. Podłącz każdy drut łączący do jednego drutu wolframowego za pomocą odpowiednio jednej kropli farby przewodzącej srebro. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 30 minut.
5. Nałożyć minimalną ilość cementu, aby przykryć druty. Nie nakładaj cementu na druty wolframowe, które zostaną wprowadzone do tkanki mózgowej, ani do górnej części złącza nano. Pozostaw cement do wyschnięcia na co najmniej 30 minut.
6. Wykonać cięcie kątowe (5-20°) drutów wolframowych za pomocą nożyczek ze stali nierdzewnej, aby umożliwić niezawodne zagnieżdżenie drutów poniżej lub powyżej strefy brzusznie przylegającej do warstwy piramidalnej, gdzie amplituda theta jest zbyt niska, aby oszacować wierność porwania.
7. Odizoluj końcówkę (około 2 mm) przewodu uziemiającego za pomocą skalpela, aby zeskrobać izolację. Potraktuj go topnikiem i lutem wstępnym.
8. Sprawdź potencjalne przesłuchy między elektrodami za pomocą multimetru cyfrowego. Podłącz styki złącza do multimetru, który musi być ustawiony na tryb pomiaru rezystancji. Sprawdź parami kombinacje kanałów; odczyt na multimetrze poniżej 5 MΩ wskazuje na znaczny przesłuch.
9. Użyj miernika impedancji, aby sprawdzić impedancję każdego drutu elektrodowego w soli fizjologicznej. Typowe wartości impedancji wynoszą poniżej 100 kΩ.
10. Aby ułatwić implantację, przyklej jedno włókno światłowodowe do układu drutów tak, aby końcówka światłowodu znajdowała się na poziomie najkrótszego drutu, a końcówka światłowodu znajdowała się w bliskiej odległości, ale nie dotykała drutów wolframowych. Utrzymuj kąt włókna tak mały, jak to możliwe, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki podczas implantacji.

3. Implantacje stereotaktyczne

1. Usuń tkankę łączną z górnej części czaszki i dokładnie dociśnij mięśnie szyi o około 2 mm, aby zapobiec artefaktom mięśniowym podczas nagrywania.
2. Oczyść czaszkę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i soli fizjologicznej, a następnie wywierć cztery otwory (2 z przodu i dwa nad móżdżkiem, średnica 0,8 mm), aby umieścić ze stali nierdzewnej (00-96x1/16) do szlifowania i stabilizacji implantu (ryc. 1D). Umieść uziemiającą podłączoną do jednego drutu miedzianego (o długości około 2-3 cm) nad móżdżkiem.
3. Całkowicie przykryj uziemiającą cementem, aby zapobiec artefaktom mięśniowym podczas zapisów elektrofizjologicznych. Zbuduj cementowy pierścień łączący wszystkie (rysunek 1E).
4. Wykonaj kraniotomię powyżej strony implantacji (Hipokamp, AP -1,94, L 1,4, V 1,4 w odniesieniu do bregmy). Nałóż około 5 μl sterylnego NaCl na powierzchnię tkanki mózgowej.
5. Powoli opuść układ drutów za pomocą stereotaksji w kraniotomii. W przypadku nagrań jednolitych należy wszczepić sondę silikonową zamiast układu przewodów. Aby zapobiec artefaktom światła optoelektrycznego, wszczepić światłowód oddzielnie w hipokampie, tak aby końcówka światłowodu nie była skierowana bezpośrednio w stronę sondy (rysunek 1C—I). W celu zbadania koordynacji porywania między półkulami należy wszczepić dodatkowy światłowód w przeciwległym obszarze hipokampa CA1.
6. W celu ochrony tkanki mózgowej należy nałożyć około 5 μl ciepłego płynnego wosku/oleju parafinowego, podgrzanego w temperaturze 70 °C, za pomocą strzykawki nad miejscem implantacji.
7. Nałóż cement wokół siatki drucianej i przykryj czaszkę cementem.
8. Nałóż jedną kroplę topnika na wstępnie przylutowany przewód uziemiający/odniesienia i wstępnie przylutowany przewód podłączony do uziemiającej za pomocą, na przykładample, igły, i połącz przewody za pomocą lutownicy.
9. Przykryj cały przewód uziemiający cementem.
10. Podawać 0,3 ml eryciny (1:4 w sterylnym NaCl) i karprofenie (5 mg/ml) docelowo po zabiegu chirurgicznym i przez co najmniej dwa dni po zabiegu. Mysz zazwyczaj budzi się w ciągu 15 minut po operacji. Ogrzej zwierzę czerwoną lampą, aby przyspieszyć powrót do zdrowia.
11. Codziennie monitoruj masę ciała myszy przez pierwszy tydzień po operacji lub do momentu, gdy się ustabilizuje. Utrata masy ciała nie powinna przekraczać 10% masy ciała zarejestrowanej myszy przed zabiegiem. Aby przyspieszyć stabilizację wagi, w pierwszych dniach po operacji podawaj myszy mokrą karmę i mleko skondensowane.
12. Aby zarejestrować aktywność komórkową hipokampa podczas porywania, wszczepij silikonową sondę do hipokampa (AP -1,94, L 1,4, V 1, z późniejszym obniżeniem) (Figura 1C-I). Wszczepić światłowód w hipokampie w AP -3, L 1,4, V 1,6, 39° ogonowo-rostralnym. Jeśli pożądana jest stymulacja somatów komórkowych, należy wszczepić dodatkowy światłowód w MS (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° boczny).

Wyniki

Rysunek 1: Ilustracja przedstawiająca światłowody, elektrody i chirurgię. (A) Ilustracja światłowodu. (B) Ilustracja układu drutowego przyklejonego do światłowodu w celu rejestracji LFP w hipokampie podczas porywania oscylacji theta w hipokampie. (C) W celu rejestrowania aktywności komórkowej hipokampa silikonowa sonda jest zamontowana na mikronapęd...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy PV-Cre	Laboratorium Jacksona	B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Taksówka stereo	David Kopf Instruments, Tujunga, Kalifornia, Stany Zjednoczone	wzoru 963	Ultra precyzyjny instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt
Wiertła 0,8 mm	Bijoutil, Allschwil, Szwajcaria	49080HM
Stacja lutownicza	Weller Tools GmbH, Besigheim, Niemcy	Zobacz materiał WSD 81
erytromycyna	Rotexmedica GmbH, Trittau, Niemcy	PZN: 10823932	1g proszku do sporządzania roztworu do infuzji
Wiertarka/szlifierka precyzyjna	Proxxon, Wecker, Luksemburg	FBS 240/E
Światłowód wielomodowy	ThorLabs, Dachau, Niemcy	FG105LCA	0,22 NA, Low-OH, rdzeń Ø105 μm, 400 - 2400 nm
Ceramiczna skuwka w sztyfcie	Produkty z włókien precyzyjnych, Milpitas, CA, USA	CFLC126	Ceramiczna tuleja LC MM, ID 126um
Papier do polerowania	Tholabs powiedział:	LF3D	6 "x 6" Diamentowy arkusz docierania (polerowania)
Miernik mocy	Tholabs powiedział:	Pył zawieszony PM100D	Kompaktowa konsola licznika mocy i energii, cyfrowa 4" LCD
Łącznik światłowodowy wielomodowy	Tholabs powiedział:	FCMM50-50A-FC	Łącznik 1x2 MM, współczynnik podziału 50:50, włókna GI 50 μm, FC/PC
Patchcord światłowodowy	Tholabs powiedział:	FG105LCA CUSTOM-MUC	wykonane na zamówienie, długość 3 m, z rurką ochronną, Wężyk: FT030, Złącze 1: FC/PC, Złącze 2: Tuleja ceramiczna 1,25 mm (LC)
rękaw	Produkty z włókien precyzyjnych, Milpitas, CA, USA	Biblioteka ADAL1	Ceramiczna tuleja dzielona do okuć Ø1,25 mm (LC/PC)
Druty wolframowe	Kalifornijska firma zajmująca się cienkim drutem, Grover Beach, Kalifornia, Stany Zjednoczone	CFW0010954	40 μm, 99,95%
Rurki kapilarne	Optoelektronika	1068150020	Średnica ID: 100,4 μm
Nanozłącze Omnetics	Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, Stany Zjednoczone	A79038-001
	Bilaney, Düsseldorf, Niemcy	Numer katalogowy: 00-96x1/16	Stal nierdzewna
Srebrna farba przewodząca	Conrad electronics, Niemcy	530042
Topnik cieczy	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Niemcy	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)