$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie linii komórkowej
- Rozmrozić około 1 000 000 mysich komórek nerwiaka zarodkowego rdzenia kręgowego (komórki NSC-34), które były przechowywane w pojemniku z ciekłym azotem. Użyj inkubatora wodnego o temperaturze 37 °C, aż komórki całkowicie się rozmrozą.
- Dodaj świeżą, ciepłą pożywkę (pożywkę DMEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% antybiotyków pen-strep).
- Odwirować rozmrożone komórki (SL16R) w ilości 500 x g przez 5 minut, tworząc osad komórkowy. Odrzucić pożywkę i dodać 1 ml nowej pożywki do ponownego wytworzenia komórek.
- Umieścić zawieszone komórki w kolbie o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 5 ml pożywki. Inkubować komórki przez noc w sterylnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Równolegle umieść 8 niepowlekanych szkiełek nakrywkowych (szkło nakrywkowe: 12 mm, grubość 0,13-0,17 mm) w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i sterylizuj przy użyciu 70% etanolu i ekspozycji na 30 minut światła UV, aż wyschnie. Dodaj podłoże do każdego naczynia i wylej, aby zmyć resztki etanolu.
- Dodaj bufor trypsyny (2,5 g trypsyny i 0,2 g EDTA w 1 litrze zbilansowanego roztworu soli Hanksa) do komórek po osiągnięciu około 90% konfluencji (około 6 milionów komórek na kolbę), aby umożliwić przylegającym komórkom dysocjację.
UWAGA: Komórki NSC-34 są wrażliwe i wymagają tylko 15 s inkubacji bufora trypsyny i 1 dodatkowej minuty inkubacji bez trypsyny przed dysocjacją przy użyciu pożywki.
- Umieść komórki na 60-milimetrowych szalkach hodowlanych zawierających szkiełka nakrywkowe z 3 ml pożywki, około 350 000 na szalkę. Pozostaw je w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić przyczepienie komórek do szkiełek nakrywkowych.
2. Walidacja ekspresji białek
- Umieścić na lodzie 60-milimetrowe szalki hodowlane zawierające resztki komórek (niewykorzystane w powyższym doświadczeniu).
- Wyrzucić pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu rozcieńczenia i umycia pozostałej pożywki.
- Potraktuj komórki 200-400 μl buforu do lizy zawierającego PBS, 0,5% Triton i tabletkę koktajlową inhibitora proteazy (PI). Zeskrobać za pomocą skrobaka do komórek.
- Zebrać komórki w buforze do lizy w probówce mikrowirówki i homogenizować z homogenizatorem przy 4,000 obr./min przez 1 minutę pod lodem.
- Odwirować homogenizowane komórki w temperaturze 2 500 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant, określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu Bradforda i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
- Zebrać od 30 do 70 μg białka całkowitego (w zależności od białka) i załadować je do żelu SDS-PAGE w celu zbadania ekspresji białka za pomocą testu immunobloksowego.