1. Określanie względnej ekspresji białek na powierzchni komórki w astrocytach za pomocą biotynylacji
UWAGA: Tutaj ilustrujemy zastosowanie tej techniki biotynylacji do badania wpływu cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej lamininy na lokalizację na powierzchni komórki przepuszczalnego dla wody kanału akwaporyny-4 (AQP4). Specjalistyczne materiały wymagane do tego testu obejmują sulfo-NHS-LC-biotynę (heksanian 6-(biotinamido) sulfosukcynimidylu) sulfosukcynimidylu) i żywicę streptawidyno-agarozową (patrz tabela materiałów).
- Za pomocą tej metody należy przygotować kultury astrocytów korowych na około 2 tygodnie przed testem i wyhodować je w 75 cm2 wentylowanych kolbach hodowlanych. Gdy astrocyty są zlewające się w 80 - 90%, należy je oderwać od powierzchni hodowli za pomocą 0,05% trypsyny, a następnie przejść je w stosunku 1:3.
- Po 48 godzinach przed badaniem, gdy komórki są ponownie zlewające się w 80 - 90%, astrocyty pasują 1:3 (uwzględniając zmianę formatu hodowli) na 60-milimetrowe szalki do hodowli komórkowych, tak aby w dniu, w którym ma się odbyć eksperyment, były w >70% zlewane. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone między naczyniami.
- Po 16 godzinach przed badaniem pipetować lamininę do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 24 nM i inkubować w temperaturze 37 °C.
- Bezpośrednio przed oznaczeniem należy przygotować następujące substancje, a następnie umieścić je na lodzie lub wstawić do lodówki: CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O i 100 mg/L CaCl2 w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem [PBS], pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotyny w CM-PBS), bufor wygaszający (50 mM NH4Cl w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% dodecylosiarczan sodu [SDS], 30% glicerol, 300 mM ditiotreitol [DTT] i 0,01% błękit bromofenolowy) i bufor do przemywania (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy).
- Wyjąć z inkubatora szalki zawierające kultury astrocytów i wyrzucić pożywkę.
- Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.
- Odpipetuj 2 ml buforu biotyny do każdego dołka i delikatnie przechyl szalki kilka razy w przód i w tył, aby zapewnić pełne pokrycie. Pozostaw na lodzie na 30 minut.
- Usunąć bufor biotyny za pomocą aspiratora i zastąpić go buforem hartującym o pojemności 4 ml. Pozostaw na lodzie na 10 minut.
- Zassać bufor hartowniczy i zastąpić go równoważną objętością tego samego. Ponownie pozostaw na lodzie na 10 minut.
- Odrzucić bufor hartowniczy i trzykrotnie przemyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS.
- Zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego CM-PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej.
- Granulki osadzać przez odwirowanie w stężeniu 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do lizy.
- Pozostawić próbki na lodzie na 30 minut, wirując co 5 minut, lub umieścić je na rotatorze typu "koniec do końca" w temperaturze 4 °C.
- Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wszelkich materiałów nierozpuszczalnych w detergentach. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
- Zaoszczędź 50 μl tego lizatu i dodaj do niego bufor ładujący. Następnie poddać go denaturacji poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka powierzchniowe komórek, jak i niebiotynylowane białka cytozolowe.
- Poszerz otwór końcówki pipety, odcinając około 0,5 cm materiału od jej końca za pomocą ostrych nożyczek. Za pomocą tej końcówki pipety przenieść 75 μl kulek streptawidyny-agarozy (normalnie przechowywanych w temperaturze 4 °C) do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na wytrząsarce/kołysce.
- Ponieważ paciorkowcowo-agaroza jest często sprzedawana w postaci zawiesiny zawierającej 50% objętości kulek, zawieszonych w roztworze przeciwdrobnoustrojowym, należy rozprowadzić zawiesinę, aby zapewnić równomierne zawieszenie kulek, a następnie odpipetować 150 μl zawiesiny do każdej próbki.
- Granulki streptawidyny-agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
- Należy zachować 50 μl supernatantu (dodać bufor ładujący i poddać go denaturacji w temperaturze 95 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym); stanowi on frakcję "wewnątrzkomórkową" i składa się głównie z niebiotynylowanych białek cytozolowych.
- Ponownie zawiesić granulki w 1 ml buforu do przemywania i kołysać go przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki osadu (jak w kroku 1.16) i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4x, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.
Granulki obrabić - przez odwirowanie (1500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C) i wyrzucić leżący nad nimi bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać wyłącznie biotynylowane białka powierzchniowe (frakcja "powierzchnia komórki").
- Oddziel frakcje wejściowe, powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe za pomocą SDS-PAGE (elektroforeza w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu) i przeanalizuj za pomocą western blotting.
nuta: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układającą (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.