$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Określanie szybkości internalizacji białek powierzchniowych komórek w astrocytach za pomocą biotynylacji
UWAGA: Poniżej opisujemy typowy eksperyment biotynylacji z impulsem, używany w tym przypadku do śledzenia endocytozy AQP4 w astrocytach. Wymagane specjalistyczne materiały obejmują sulfo-NHS-SS-biotynę, żywicę streptawidyno-agarozową, zredukowany glutation i jodoacetamid (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj hodowle astrocytów korowych myszy w 60-milimetrowych szalkach, stosując metody opisane w poprzednim rozdziale. Upewnij się, że komórki zlewają się w około 70% w dniu testu i że każda szalka zawiera równoważną liczbę komórek.
- Bezpośrednio przed oznaczeniem należy przygotować następujące substancje i umieścić je na lodzie lub w lodówce: CM-PBS lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (100 mg/L MgCl2∙6H2O i 100 mg/L CaCl2 w 1X PBS, pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-SS-biotyny w CM-PBS), bufor redukujący (50 mM zredukowany glutation, 75 mM NaCl i 75 mM NaOH), bufor wygaszający (50 mM jodoacetamid, 1% BSA, w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA lub kwas etylenodiaminotetraoctowy, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS lub dodecylosiarczan sodu, 30% glicerol, 300 mM DTT lub ditiotreitol i 0,01% błękit bromofenolowy), i bufor do przemywania (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy).
- Przygotuj świeże podłoże do hodowli komórkowych (Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco; lub DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy) i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Usuń kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę za pomocą aspiratora.
- Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.
- Odpipetuj 3 ml buforu biotyny do każdego naczynia, przechyl naczynia kilka razy w przód i w tył, aby upewnić się, że bufor jest dobrze rozprowadzony, i pozostaw na lodzie na 30 minut.
- Odessać bufor biotyny i zastąpić go 5 ml ciepłej pożywki. Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a drugą szalkę w tej samej temperaturze przez 30 minut. Pozostawić inne naczynie w temperaturze 4 °C jako próbkę 0 min.
- Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS. Odpipetować 6 ml buforu redukującego na komórki i pozostawić je na lodzie na 15 minut.
- Usunąć bufor redukcyjny i zastąpić go 6 ml świeżego buforu redukującego. Umieść mieszaninę na lodzie na dodatkowe 15 minut.
- Usunąć roztwór redukujący i zastąpić go 6 ml buforu hartującego. Pozostaw na lodzie na 15 minut.
- Powtórz etap hartowania jeszcze raz.
- Odrzucić bufor gaszący i przemyć komórki trzykrotnie 4 ml schłodzonego PBS.
- Za pomocą podnośnika komórkowego zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego PBS i przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki.
- Osadzać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze do lizy
.
- Pozostaw to na lodzie na 30 minut i wiruj co 5 minut. Alternatywnie, umieść próbki na rotatorze typu end---end w temperaturze 4 °C na ten czas.
- Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia materiałów nierozpuszczalnych w detergentach, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj 50 μl tego lizatu, dodaj do niego bufor ładujący i poddaj denaturacji w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka endocytozowane, jak i białka niebiotynylowane.
- Za pomocą odciętej końcówki pipety dodać 150 μl zawiesiny streptawidyny i agarozy do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na shakerze/kołysce.
- Granulki streptawidyny i agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić kulki w 1 ml bufora do przemywania i rozdrabniać przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki osadu (jak w kroku 1.18) i odrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4 razy, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.
- Granulki osadu przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i wyrzucić leżący nad nim bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać tylko zinternalizowane białka powierzchniowe komórki (frakcja "endocytozowana").
- Oddziel frakcje wejściowe, powierzchniowe i niezwiązane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i przeanalizuj za pomocą western blotting.
nuta: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układającą (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.