Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny

Streszczenie

Źródło: Tham, D. K. L., et al., Określanie ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje metodę oceny internalizacji docelowego białka w astrocytach korowych myszy za pomocą biotynylacji, a następnie lizy komórek, ekstrakcji białka na bazie streptawidyny, denaturacji i analizy Western blot w celu potwierdzenia udanej internalizacji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Określanie szybkości internalizacji białek powierzchniowych komórek w astrocytach za pomocą biotynylacji

UWAGA: Poniżej opisujemy typowy eksperyment biotynylacji z impulsem, używany w tym przypadku do śledzenia endocytozy AQP4 w astrocytach. Wymagane specjalistyczne materiały obejmują sulfo-NHS-SS-biotynę, żywicę streptawidyno-agarozową, zredukowany glutation i jodoacetamid (patrz tabela materiałów).

1. Przygotuj hodowle astrocytów korowych myszy w 60-milimetrowych szalkach, stosując metody opisane w poprzednim rozdziale. Upewnij się, że komórki zlewają się w około 70% w dniu testu i że każda szalka zawiera równoważną liczbę komórek.
2. Bezpośrednio przed oznaczeniem należy przygotować następujące substancje i umieścić je na lodzie lub w lodówce: CM-PBS lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (100 mg/L MgCl₂∙6H₂O i 100 mg/L CaCl₂ w 1X PBS, pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-SS-biotyny w CM-PBS), bufor redukujący (50 mM zredukowany glutation, 75 mM NaCl i 75 mM NaOH), bufor wygaszający (50 mM jodoacetamid, 1% BSA, w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA lub kwas etylenodiaminotetraoctowy, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS lub dodecylosiarczan sodu, 30% glicerol, 300 mM DTT lub ditiotreitol i 0,01% błękit bromofenolowy), i bufor do przemywania (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy).
3. Przygotuj świeże podłoże do hodowli komórkowych (Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco; lub DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy) i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Usuń kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę za pomocą aspiratora.
5. Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.
6. Odpipetuj 3 ml buforu biotyny do każdego naczynia, przechyl naczynia kilka razy w przód i w tył, aby upewnić się, że bufor jest dobrze rozprowadzony, i pozostaw na lodzie na 30 minut.
7. Odessać bufor biotyny i zastąpić go 5 ml ciepłej pożywki. Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a drugą szalkę w tej samej temperaturze przez 30 minut. Pozostawić inne naczynie w temperaturze 4 °C jako próbkę 0 min.
8. Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS. Odpipetować 6 ml buforu redukującego na komórki i pozostawić je na lodzie na 15 minut.
9. Usunąć bufor redukcyjny i zastąpić go 6 ml świeżego buforu redukującego. Umieść mieszaninę na lodzie na dodatkowe 15 minut.
10. Usunąć roztwór redukujący i zastąpić go 6 ml buforu hartującego. Pozostaw na lodzie na 15 minut.
11. Powtórz etap hartowania jeszcze raz.
12. Odrzucić bufor gaszący i przemyć komórki trzykrotnie 4 ml schłodzonego PBS.
13. Za pomocą podnośnika komórkowego zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego PBS i przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki.
14. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze do lizy
.
15. Pozostaw to na lodzie na 30 minut i wiruj co 5 minut. Alternatywnie, umieść próbki na rotatorze typu end---end w temperaturze 4 °C na ten czas.
16. Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia materiałów nierozpuszczalnych w detergentach, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj 50 μl tego lizatu, dodaj do niego bufor ładujący i poddaj denaturacji w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka endocytozowane, jak i białka niebiotynylowane.
17. Za pomocą odciętej końcówki pipety dodać 150 μl zawiesiny streptawidyny i agarozy do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na shakerze/kołysce.
18. Granulki streptawidyny i agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
19. Zawiesić kulki w 1 ml bufora do przemywania i rozdrabniać przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki osadu (jak w kroku 1.18) i odrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4 razy, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.
20. Granulki osadu przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i wyrzucić leżący nad nim bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać tylko zinternalizowane białka powierzchniowe komórki (frakcja "endocytozowana").
21. Oddziel frakcje wejściowe, powierzchniowe i niezwiązane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i przeanalizuj za pomocą western blotting.
    nuta: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układającą (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A9647-50
Błękit bromofenolowy	Bio-Rad	#1610404
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	11697498001
Dihydrat etylenodiaminotetraoctanu disodowego (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Ditiotreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	Numer katalogowy 11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotyna	Thermo Fisher Naukowy	#21331
Surowica bydlęca płodu	Gibco/Thermo Fisher Scientific	Numer katalogowy: 16000-044
glicerol	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP229-1
glicyna	Sigma-Aldrich	Klasa g8898
Jodoacetamid	Bio-Rad	#163-2109
L-glutamina	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
Penicylina/streptomycyna	Gibco/Thermo Fisher Scientific	Rozdział 15140-122
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Laboratoria ImmunoResearch Jacksona	Numer katalogowy: 111-035-045
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	Gibco/Thermo Fisher Scientific	Numer katalogowy 10010-023
Zredukowany glutation	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G6529
Chlorek sodu (NaCl)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S271-500
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 862010
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S318-100
Żywica agarozowa streptawidyny	Thermo Fisher Naukowy	#20347
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-AQP4	Alomone (Alomone)	AQP-004
Baza Tris (baza Trizma)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1
Tris-HCl	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP153-1
Tryton X-100	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP151-500

powiedział: powiedział: