Ocena atrakcyjnej lub odpychającej aktywności białek za pomocą neuronów hipokampa

Streszczenie

Źródło: Yamagishi, S. et al., Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje metodę oceny aktywności białek za pomocą neuronów hipokampa nad wzorzystymi strefami białkowymi. Neurony wykazują odpychanie w strefach białek testowych i przyłączanie się w strefach białek kontrolnych, podkreślając efekty atrakcyjnej lub odpychającej aktywności białek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie matryc

1. Gotuj 4-8 matryc silikonowych w kuchence mikrofalowej lub na płycie grzejnej przez 5 minut i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na 1 godzinę pod przepływem laminarnym (paskami do góry).
   nuta: Poniższe procedury należy wykonywać przy przepływie laminarnym.
2. Przedmuchaj sprężonym powietrzem lub użyj przezroczystej taśmy klejącej, aby usunąć kurz z pasiastej strony matryc. Utrzymuj stronę w paski w czystości, aby mogła mocno przylegać do powierzchni płyty.
3. Ostrożnie umieść matryce na plastikowych naczyniach o średnicy 6 cm, naciskając palcem (po jednej matrycy na naczynie; paskiem do dołu). Unikaj dostania się pęcherzyków powietrza między matrycę a naczynie. Zaznacz położenie pasków na dolnej stronie naczynia hodowlanego.
4. Jeśli nie uda się przyczepić matrycy, powtórz czynności od kroku 1.2.

2. Wytwarzanie pasków i powlekanie laminy w hodowli neuronów

1. Przygotować znakowane fluorescencyjnie rekombinowane białko (po 25 μl do wstrzykiwań [krok 2.2] lub po 100 μl do metody umieszczania [krok 2.2.1]) przez zmieszanie białka znakowanego Fc (10-50 μg/ml) i fluorescencyjnego przeciwciała anty-ludzkiego Fc sprzężonego z barwnikiem (stosunek 1 do 3: 30-150 μg / ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Następnie inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Za pomocą strzykawki 22 G wstrzyknąć 25 μl rekombinowanego białka przygotowanego w poprzednim kroku (2.1) przez mały otwór z boku matrycy (strzałki na rysunku 1A, 1C i 1E).
   1. Alternatywnie, umieścić 100 μl rekombinowanego białka w górnej szczelinie matrycy i odessać około połowy roztworu z małego otworu (strzałki na rysunku 1A, 1C i 1E), tak aby rekombinowane białko pozostało w pasiastych obszarach.
3. Inkubować szalkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
4. Umieścić 300 μl PBS w górnej szczelinie (ryc. 1B) i odessać z małego otworu znajdującego się z boku matrycy (strzałki na rysunku 1A, C i E) w celu usunięcia nieprzyłączonych rekombinowanych białek. Nie zasysaj całkowicie PBS, ponieważ białka wyschną. Powtórz ten krok dwukrotnie. (Razem 3 razy)
5. Ostrożnie usunąć matrycę i natychmiast umieścić ~100 μl białka kontrolnego (10-50 μg/ml; Fc), aby pokryć cały obszar w paski, tworząc alternatywną powłokę. Następnie inkubować naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
6. Po trzykrotnym umyciu powierzchni naczynia PBS, pokryj ją ~100 μl 20 μg/ml lamininy w PBS.
   nuta: Lamininę należy rozmrażać na lodzie, aby zapobiec krzepnięciu.
7. Inkubować naczynie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
8. Umyj powierzchnię naczynia trzykrotnie PBS i dodaj pożywkę hodowlaną. Umieścić pokryte naczynie z pożywką hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C do momentu użycia.

3. Hodowla neuronów hipokampa z embrionów myszy E15.5

1. Poddać matkę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i wyizolować trzy zarodki E15.5.
2. Przetnij nożyczkami skórę i czaszkę strzałkowo w linii środkowej głowy i usuń mózg za pomocą małej łyżki. Ostrożnie przenieś mózg na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 3 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).
3. Za pomocą skalpela wytnij półkule, w tym korę, hipokamp i prążkowie (ryc. 2A). Następnie należy wypreparować obszar hipokampa, ostrożnie usuwając opony mózgowe, a następnie przenieść wypreparowane tkanki hipokampa do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 2 ml roztworu HBSS na lodzie (ryc. 2B-C). Zbierz 6 hipokampów z 3 zarodków w probówce, które wystarczą do hodowli neuronów w 8 szalkach.
4. Zastąpić roztwór HBSS roztworem trypsyny/etylenodiaminy tetraoctowej (trypsyna/EDTA) (2 ml) i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut w łaźni wodnej.
   nuta: Zassać HBSS bez wirowania i nie dekantować roztworu HBSS poprzez przechylanie probówki.
5. Zneutralizuj aktywność trypsyny, dodając 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
6. Odwirować mieszaninę przy 100 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad 2 ml pożywki. Powtórz ten krok jeszcze raz.
7. Pipetuj hipokampy w górę i w dół 10 razy w pożywce hodowlanej, używając końcówki o pojemności 1000 μl z dużym otworem (odciętą końcówką), aby zdysocjować tkankę.
8. Zmień końcówkę na zwykłą (nieoszlifowaną) o pojemności 1000 μl i pipetuj zdysocjowaną tkankę w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
9. Oddziel pojedyncze komórki, przepuszczając je przez sitko siatkowe o wielkości 80-100 μm.
10. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę jednokomórkową o sile 150 x g przez 5 minut.
11. Usunąć supernatant przez zasysanie i ponownie zawiesić osad (neurony) w 2 ml pożywki hodowlanej.
12. Policz komórki za pomocą hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, aby określić gęstość i żywotność. Następnie umieść 10 000 neuronów w 150 μl pożywki hodowlanej dla każdego zestawu pasków. Zawieszenie należy ostrożnie umieścić, aby pokryć cały obszar paska.

Wyniki

Rysunek 1. Matryca krzemowa użyta do stworzenia stempla białkowego w paski. (A, B) Widok z góry na matrycę krzemową. Wymiary matrycy to 30 mm x 25 mm x 5mm. Biała strzałka w A wskazuje mały otwór, do którego wstrzykiwane jest rekombinowane białko (krok 2.2). Grot strzałki w B oznacza szczelinę, w której alternatywnie stosuje się rekombinowane białko (krok 2.2.1). (C, D) Widok z dołu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka wirówkowa 15 ml	Wiolina	Numer katalogowy: 1-3500-01
Alexa Fluor 488 Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG	Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Przeciwciało anty-mysie IgG osła	Thermo Scientific	A-21203	Rozcieńczenie 1/500
Suplement witaminy B27	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 17504-044	Rozcieńczenie 1/50
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	01-2030-2
Sitko do komórek 100 um	BD Sokół	Numer telefonu 352360
Maszyna do wirowania	Kubota	2410
Długopis DAKO	DAKO	S2002	Można użyć alternatywnego wstrzykiwacza hydrofobowego
Skalpel jednorazowy	pióro	2975#11
FBS (Sieć Usługowa	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 10437-028
Kleszcze nr 5	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11254-20
GlutaMAX	Thermo Scientific	Numer telefonu 35050-061	Rozcieńczenie 1/200
Strzykawka Hamilton	Hamilton	Zobacz materiał 805N	Miernik 22, 50 uL
HBSS (Sieć HBSS)	Thermo Scientific	Nr kat. 14170-112
Ludzka IgG, fragment Fc	Jackson	Numer katalogowy: 009-000-008
Laminina	Thermo Scientific	23017-015
Neuropodstawowy	Thermo Scientific	21103-049
Pbs	Nacalai (Nacalai)	Rozdział 14249-24
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 15070-063	Rozcieńczenie 1/100
Naczynie hodowlane z tworzywa sztucznego, 60 mm	Thermo Scientific	150288
Matryce silikonowe			Dostępne i do kupienia u prof. Martina Bastmeyera (bastmeyer@kit.edu)
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ61
Końcówka, 1000 uL	Watson	125-1000S
Przezroczysta taśma klejąca	Taśma tesa	Numer katalogowy: 57315	Można użyć alternatywnej taśmy klejącej
Błękit trypanowy, 0,4%	Bio-Rad	Numer katalogowy: 145-0013
Trypsyna/EDTA	Thermo Scientific	25300-054
Pożywka hodowlana			Neurobasal uzupełniony o B27, GlutaMAX i Penicylinę-Streptomycynę.