Dostarczenie urazowego uszkodzenia mózgu do mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Zhong, J., et al. Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film pokazuje przebieg urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u myszy. Po odsłonięciu czaszki zaznacza się miejsce TBI. Mysz jest następnie umieszczana pod urządzeniem TBI. Uderzenie odbywa się poprzez podniesienie metalowego pręta i umożliwienie mu swobodnego opadnięcia na impaktor, który styka się z czaszką.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przeprowadzanie powtarzającego się urazowego uszkodzenia mózgu (TBI)

UWAGA: Parametry TBI są dostosowywane w stosunku do poprzednich raportów, w których wpływ TBI został dostarczony raz. Protokół w tym miejscu stosuje ten sam parametr, z wyjątkiem zwiększenia całkowitej liczby wpływu do 10.

1. Sprzęt TBI
   1. Użyj specjalnie skonstruowanego urządzenia przenośnego, aby podać TBI z zamkniętą czaszką (Rysunek 1A) do głowy myszy po prawej stronie, jak pokazano na Rysunku 1B.
2. Przygotowanie przed zabiegiem
   1. Sprzęt do chirurgii w autoklawie, w tym zwykłe nożyczki, suwmiarka chirurgiczna, chirurgiczne nożyczki sprężynowe, kleszcze chirurgiczne, kleszcze do komarów, kawałki słupka głowy, gaza i aplikatory z bawełnianą końcówką.
   2. Zważ i zapisz masę ciała myszy na 2 godziny przed zabiegiem. Aby zminimalizować obrzęk mózgu podczas implantacji okna czaszkowego, należy wstrzyknąć fosforan sodu deksametazonu w dawce 4,8 mg/kg [2 mg/mL, zwykle ~70 μl (należy wstrzyknąć w dwa miejsca)] do mięśnia czworogłowego uda za pomocą strzykawki insulinowej. Po wstrzyknięciu deksametazonu, ale przed rozpoczęciem operacji TBI, należy przygotować szklane okienka zgodnie z zaleceniami w kroku 2.1 do późniejszego użycia.
   3. Zdezynfekuj scenę chirurgiczną i sprzęt TBI przy użyciu 75% etanolu. Rozwiń jednorazową sterylną serwetę chirurgiczną, aby pokryć etap operacji na platformie stereotaktycznej. Włącz urządzenie grzewcze i monitor temperatury, ustawiając temperaturę docelową na 37 °C.
   4. Otwórz zawór butli tlenu i wyreguluj przepływ tlenu na 1,5 l/min. Otwórz aparat anestezjologiczny i ustaw wartość poziomu izofluranu na trzy.
      UWAGA: 100% czysty tlen może pomóc zwierzęciu przetrwać uderzenia TBI.
   5. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i pozostaw ją na 5 minut, aby uzyskać pełne znieczulenie.
   6. Gdy mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona), wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść głowę myszy w ramce stereotaktycznej.
   7. Umieść stożek nosowy rurki anestezjologicznej nad pyskiem myszy.
   8. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu zmieszanego ze 100% czystym tlenem przy natężeniu przepływu 1 l/min do końca zabiegu. Okresowo sprawdzaj częstotliwość oddechu i szczyp ogon lub palec u nogi co najmniej co 15 minut przez cały czas trwania operacji, aby ocenić odpowiednie znieczulenie. Dostosuj stężenie izofluranu w zależności od potrzeb, aby utrzymać pożądaną głębokość znieczulenia.
3. Operacja TBI
   1. Podawać buprenorfinę (1 mg/kg mc., podskórnie) za pomocą jednorazowych strzykawek insulinowych i nakładać maść okulistyczną na oczy myszy.
   2. Usuń włosy z czubka głowy, przycinając je nożyczkami 1, a następnie nakładając środek do depilacji na 1 min.
      UWAGA: Nie nakładaj środka do depilacji na skórę głowy na dłużej niż 3 minuty, ponieważ działa drażniąco na skórę. Unikaj również dostania się środka do depilacji do oczu myszy.
   3. Oczyść skórę głowy, nakładając gazę i aplikatory z bawełnianą końcówką. Następnie zdezynfekuj skórę, używając najpierw 75% etanolu, a następnie betadyny. Powtórz to trzy razy (tj. etanol, a następnie betadyna), pozostawiając ostateczną aplikację betadyny na skórze.
   4. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona). Owiń skórę kleszczami chirurgicznymi 3 i wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 12-15 mm, zaczynając około 3 mm z tyłu od oczu.
   5. Wytnij skórę nad lewą i prawą półkulą czaszki za pomocą nożyczek sprężynowych 2.
   6. Po odsłonięciu czaszki usuń okostną, delikatnie pocierając ją sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i spłukując sterylną solą fizjologiczną.
   7. Sprawdź wzrokowo stan czaszki, aby upewnić się, że jest nienaruszona, z wyjątkiem dwóch małych otworów, które zostały wykonane na potrzeby poprzedniej operacji wstrzyknięcia wirusa.
   8. Osusz obszar czaszki i zaznacz miejsce uderzenia TBI na następujących współrzędnych: 2,5 mm za Bregmą i 2 mm bocznie od szwu strzałkowego w prawo (ryc. 1B).
   9. Szybko wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i połóż głowę na poduszce buforowej pod urządzeniem TBI.
   10. Dopasuj końcówkę impaktora do zaznaczonego miejsca uderzenia.
   11. Podnieś metalową kolumnę, ciągnąc nylonowy sznurek na uwięzi 15 cm nad głową myszy, a następnie zwolnij go, pozwalając ciężarkowi swobodnie opaść na pręt przetwornika, który styka się z czubkiem czaszki w miejscu TBI. Nie dotykaj głowicy myszy podczas uderzania TBI.
   12. Przesuń mysz na koc grzewczy i połóż ją na plecach, monitorując stan oddychania.
   13. Gdy mysz ustawi się z pozycji leżącej na plecach do pozycji leżącej, umieść ją w komorze indukcyjnej izofluranu na ~5 minut z 3% izofluranem zmieszanym ze 100% czystym tlenem przy natężeniu przepływu 1,5 l/min.
   14. Gdy mysz jest w pełni uspokojona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona), powtórz kroki 1.3.9-1.3.14, aby uzyskać łącznie 10 uderzeń.
       UWAGA: W naszym badaniu stwierdzono, że dziesięć uderzeń TBI indukuje silny fenotyp o niskiej śmiertelności myszy (dane jeszcze nie opublikowane). Parametry mogą być dostosowywane w celu uzyskania różnej ciężkości uszkodzenia mózgu poprzez zwiększanie lub zmniejszanie liczby uderzeń i/lub wysokości, z której ciężar jest uwalniany. Wszystkie parametry podlegają zatwierdzeniu przez lokalny IACUC.
   15. Sprawdź czaszkę pod mikroskopem chirurgicznym i usuń mysz z badania, jeśli doszło do złamania czaszki.
   16. W przypadku operacji pozorowanej należy postępować zgodnie z tymi samymi procedurami, jak opisano powyżej, w tym umieszczając zwierzę pod impaktorem, ale bez dostarczania uderzeń TBI.
   17. Po tym, jak mysz ustawi się z pozycji leżącej na plecach do pozycji leżącej po 10. uderzeniu TBI, umieść ją w komorze indukcyjnej izofluranu na ~5 minut. Następnie wykonaj kroki 1.2.6-1.2.8, aby umieścić głowę myszy na ramie stereotaktycznej w celu przeprowadzenia operacji implantacji okna czaszkowego opisanej poniżej.

Wyniki

Rysunek 1: Schematy urządzenia TBI, miejsca uderzenia TBI i przygotowania okna. (A) Wyposażenie urządzenia TBI do obniżania masy. 1: cokół, 2: wspornik, 3: regulowany zacisk, 4: nylonowy sznurek, 5: tunel do zrzucania ciężaru, 6: metalowa kolumna obciążnika (50 g), 7: impaktor, 8: poduszka buforowa. (B) Schemat wstrzyknięcia wirusa i miejsca uderzenia TBI, ze współrzędnymi 2,5 mm za Bregmą i 2 mm bo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Regulowane precyzyjne pędzle aplikatora	Parkell	Zobacz materiał S379
Strzykawka insulinowa BD	Bd	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine (Betadyna)	Purdue	NDC67618-151-17	W tym 7,5% jodu powidonu
Buprenorfina	PAR Farmaceutyczny	NDC 42023-179-05
Etonalny	Fisher Naukowy	04355223EA	75%
Aparatura grzewcza	CWE	Mysz TC-1000	Wyposażony w instrument stereotaktyczny i może być używany podczas operacji chirurgicznej
Koc grzewczy	Apteka CVS	E12107	Dodatkowe urządzenie grzewcze i może być używane po operacji
Smar maść okulistyczna	Piketal	NDC 46066-753-55
Marker	Delasco powiedział:	SMP-BK (Przekaźnik SMP-BK)
Kleszcze do komarów	Carolina	Pozycja #:625314	Stal nierdzewna, zakrzywiona, 5 cali
Środek do depilacji	Korporacja McKesson	N/a	Nair Balsam do depilacji aloesem i lanoliną do włosów
Nożyczki zwykłe 1	Eurostat	Eurostat ES5-300
Nożyczki zwykłe 2	Światowe instrumenty precyzyjne	Nr 501759-G
słony	Świat biologiczny	L19102411PR
Nożyce sprężynowe 1	Światowe instrumenty precyzyjne	Nr 91500-09	Końcówka prosta
Nożyce sprężynowe 2	Światowe instrumenty precyzyjne	Nr 91501-09	Końcówka prosta
Platforma stereotaktyczna	KOPF	modelu 900LS
Kleszcze chirurgiczne 1	MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA	Wózek katowy# 0508-5/45-PO	Wzór 5/45, zakrzywiony
Kleszcze chirurgiczne 2	MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA	catlog# 0103-5-PO	Styl 5, prosty
Kleszcze chirurgiczne 3	MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA	Dziennik kotów# 72912
Kleszcze chirurgiczne 4	MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA	Wózek katowy# 0508-5/45-PO	Wzór 5/45, zakrzywiony
Lampa chirurgiczna	Księga Leica	Leica KL300 LED
Klej do tkanek Vetbond	3M Opieka nad zwierzętami	Numer części:014006

powiedział: powiedział: