Barwienie immunologiczne fluorescencji neuronów hipokampa szczura w chipie mikroprzepływowym

Streszczenie

Źródło: Nagendran, T., et al., Użycie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne neuronów hipokampa szczura hodowanych w mikroprzepływowym chipie do analizy dojrzewania neuronów i połączeń.

Protokół

1. Barwienie immunologiczne fluorescencyjne w chipie

1. Przygotować 4% roztwór utrwalający formaldehyd w PBS (4% formaldehydu, 1 μM MgCl₂, 0,1 μm CaCl₂, 120 mM sacharozy)
2. Usuń większość nośnika z dołków chipa (nie suszyć wewnętrznych komór).
3. Natychmiast dodać 100 μl roztworu utrwalającego do górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.
4. Po 1 minutach dodać 100 μl roztworu utrwalającego do studzienek dennych. Utrwal na 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usuń większość roztworu z dołków chipa (nie suszyć wewnętrznych komór). Natychmiast dodać 150 μl PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj 2 minuty, aż PBS spłynie do studzienek dennych.
6. Powtórz krok 1.5 dwa razy.
7. Usuń większość PBS z dołków chipa. Natychmiast dodaj 150 μl PBS z 0,25% TritonX-100 do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj 15 min.
8. Usuń większość płynu z dołków chipa i natychmiast dodaj 150 μl roztworu blokującego (10% normalnej koziej surowicy w PBS) do każdego z górnych dołków przedziałów aksonalnych i somatycznych. Poczekaj 15 min.
   nuta: Skuteczne roztwory blokujące powinny być specyficzne dla przeciwciała drugorzędowego, np. w przypadku przeciwciała drugorzędowego przeciwko owcom należy użyć surowicy osła w roztworze blokującym.
9. Usuń większość płynu z dołków chipa i natychmiast dodaj 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała (lub przeciwciał) w 1% normalnej surowicy koziej w PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Przykryj, aby zminimalizować parowanie i odczekaj 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.
10. Usuń większość roztworu z dołków chipa (nie suszyć wewnętrznych komór). Natychmiast dodać 150 μl PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj 5 minut, aż PBS spłynie do studzienek dennych.
11. Powtórz krok 1.10 dwa razy.
12. Usuń większość płynu z dołków chipa i natychmiast dodaj 100 μl przeciwciała wtórnego (lub przeciwciał) w PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Przykryj, aby zminimalizować parowanie i odczekaj 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    nuta: Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje na temat zalecanego rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych.
13. Powtórz kroki 1.10-1.11.
14. W przypadku obrazowania w ciągu 1 dnia od barwienia immunologicznego należy przechowywać chip wypełniony PBS. Jeśli chip będzie przechowywany dłużej niż 1 dzień przed obrazowaniem, owiń naczynie zawierające chip folią parafinową, aby zapobiec parowaniu, i przechowuj go w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowy do obrazowania.
15. Do długotrwałego przechowywania próbek można stosować media montażowe (np. Fluoromount-G).
    1. Usuń większość płynu z dołków chipa. Użyj jednorazowej plastikowej pipety o pojemności 1 ml, aby dodać 2 krople pożywki montażowej do każdej z górnych studzienek komór aksonalnych i somatycznych.
    2. Przechyl chip, aby ułatwić przepływ mediów montażowych przez kanały. Po 5 minutach dodaj 2 krople do studzienek dennych. Odczekaj 1 godzinę przed obrazowaniem.
       nuta: Po użyciu nośnika montażowego nie będzie możliwe ponowne sondowanie w poszukiwaniu innych celów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Układ XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	Zobacz materiał XC150	Bariera mikrorowkowa o długości 150 μm
Układ XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	Zobacz materiał XC450	Bariera mikrorowkowa o długości 450 μm
Układ XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	Zobacz materiał XC900	Bariera mikrorowkowa o długości 900 μm
Powłoka wstępna XC	Xona Microfluidics, LLC	Powłoka wstępna XC	w zestawie z XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
Podłoże nerwowo-podstawowe	ThermoFisher Naukowy	21103049
Szklane pipety Pasteura	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
Przekłuwanie 16% formaldehydu	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 28906
PBS (10x)	ThermoFisher Naukowy	QVC0508
Normalna surowica kozia	ThermoFisher Naukowy	16210064
Tryton X-100	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 28314
Przeciwciało anty-vGlut1	Bakteria NeuroMab	75-066	klon N28/9, 1:100
Przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor	ThermoFisher Naukowy		godz. 17:40
System obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem	Technologia Andor	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60x olej silikonowy i 20x obiektywy