Kwantyfikacja nitkowatej aktyny punktowej w neuronach kory mózgowej szczura

Streszczenie

Źródło: Li, H., et al. Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach kory mózgowej szczura. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje procedurę fluorescencyjnego barwienia neuronów korowych szczurów do mikroskopii. Jest ukierunkowany na F-aktynę i białka dendrytyczne w celu analizy integralności strukturalnej i obliczenia gęstości F-aktyny, co ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji i zdrowia neuronów.

Protokół

1. Znakowanie fluorescencyjne i immunocytochemia

Uwaga: Znakowanie immunofluorescencyjne pierwotnych kultur komórek korowych zostało przeprowadzone w szklanych naczyniach do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i objętości roboczej 1 ml.

1. Umyj naczynie ze szklanym dnem dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4 (PBS).
2. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.
4. Traktuj komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej barwnikiem specyficznym dla aktyny F (nitkowatym), AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl falloidyny w 1 ml PBS).
5. Przepłucz komórki dwukrotnie PBS i zablokuj 10% normalną surowicą kozią w temperaturze RT przez 1-2 godziny.
6. Rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało anty-MAP2 (białko 2 związane z mikrotubulami) (1:2,500) w PBS z 2% normalną surowicą kozią i inkubować O/N (przez noc) w temperaturze 4:⁰C.
7. Po inkubacji dwukrotnie przepłukać w PBS.
8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (Alexa Red 594-sprzężone z kozim przeciwciałem IgG przeciwko kurczakowi (1:500) 2% normalnej surowicy koziej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
9. Spłucz PBS i dodaj 10 μl/naczynie barwnika Hoescht.
10. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i dwukrotnie przemyć PBS.
    nuta: Oznaczone komórki są teraz gotowe do kroku 2 (zliczanie F-aktyny puncta).
11. Zakonserwować próbkę komórkową 100 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu jako środka kryjącego szkiełko nakrywkowe i przechowywać w temperaturze 4:⁰C w ciemności do długotrwałego przechowywania.
    nuta: Faloidyna jest stosunkowo stabilna w PBS w temperaturze +4 °C w ciemności przez okres do 1 tygodnia, a fluorescencję można zachować za pomocą odczynników zapobiegających blaknięciu szkiełek nakrywkowych. Jednak optymalne obrazy uzyskuje się po 1-3 dniach od barwienia, ponieważ falloidyna może zacząć dyfundować przy dłuższym przechowywaniu.

2. Liczenie F-aktyny Puncta

1. Włącz mikroskop fluorescencyjny i przełącz na obiektyw 20×. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i skonfiguruj program o rozmiarze obrazu 1280×960 pikseli i rozdzielczości obrazu 0,17 μm/piksel przy powiększeniu 1×.
2. Uzyskaj obrazy współznakowanych neuronów F-aktyny/MAP2 pod zielonymi (495 nm) lub czerwonymi (613 nm) kanałami fluorescencyjnymi.
3. Wybierz 5 zielonych (F-aktyna)/czerwonych (MAP2) znakowanych immunologicznie/niebieskich (Hoescht) obrazów fluorescencyjnych poszczególnych neuronów z wyraźnie zaznaczonymi trzpieniami dendrytycznymi.
4. Zidentyfikuj struktury bogate w F-aktynę w segmencie dendrytycznym drugiego rzędu (zakres długości 25-75 μm) z ciągłą immunofluorescencją MAP2.
5. Obróć zaznaczony obszar obrazów do poziomu poziomego. Skopiuj i wklej jako nowy obraz.
6. Odejmij tło obrazów, stosując spójne dopasowanie dla każdego dania.
7. Policz jasnozieloną punkcję F-aktyny i ręcznie prześledź długość wybranego segmentu dendrytycznego przez przeszkolonych niezależnych obserwatorów. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.
8. Oblicz gęstość, dzieląc całkowitą puncta (N) znakowaną F-aktyną przez długość (L) dendrytów znakowanych MAP2. Wyraż dane jako liczbę F-aktyny puncta na 10 μm dendrytu
   nuta: W każdym wybranym segmencie dendrytycznym uwzględniono Puncta (wielkość ≤1,5 μm) fluorescencji F-aktyny o natężeniu piku co najmniej 50% powyżej średniej intensywności barwienia w trzonie dendrytycznym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm nr 1,5 szkło nakrywkowe	Korporacja MatTek	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 średni	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10565-018
Poli-L-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P9155
Paraformaldehyd	Sigma	Zobacz materiał P6148
AlexaFluor 488 Falloidyna	Technologie życiowe	A12379
Normalna surowica konia	Technologie życiowe	Numer katalogowy 26050-070
Poliklonalny anty-MAP2 kurczaka	Biblioteka ABCAM	AB92434
Alexa Red 594-sprzężona kozia anty-kurza IgG	Technologie życiowe	A11042
NucBlue Barwnik na żywo ReadyProbes Odczynnik Hoescht 33342	Technologie życiowe	Czynnik R37605
Pakiet oprogramowania NIS-Elements	Instrumenty firmy Nikon
Nikon Eclipse TE2000-E odwrócony fluorescencyjny mikroskop sterowany komputerowo	Instrumenty firmy Nikon

powiedział: TGL powiedział: (wersja angielska)