Izolacja włókien amyloidowych z ekstraktu z tkanki mózgowej

Streszczenie

Źródło: Upadhyay, A. et al., Biochemiczne oczyszczanie i proteomiczna charakterystyka rdzeni włókienkowych amyloidu z mózgu. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje protokół izolacji włókienek amyloidu z ekstraktu tkanki mózgowej myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości i trawienia białek nieamyloidowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Pobieranie tkanek i oczyszczanie z amyloidu

UWAGA: Idealnie, fibryle amyloidowe powinny być izolowane ze świeżo wypreparowanych obszarów mózgu. Jednak ta metoda działa również dobrze w przypadku tkanek mózgowych zamrożonych lub zamrożonych błyskawicznie. Poniżej znajduje się krótki zarys zamrażania tkanek mózgowych w celu przechowywania do wykorzystania w późniejszym czasie.

1. Pobieranie i przechowywanie tkanki mózgowej: Wypreparuj mózgi myszy i szybko zbierz obszary obciążone amyloidem (tj. korę i hipokamp), a następnie zamroź w ciekłym azocie lub kąpieli alkoholowej w suchym lodzie.
   nuta: Szybkie zamrażanie pomaga zachować cechy strukturalne składników tkanki. Myszy są poddawane eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy. Zaleca się unikanie stosowania CO_{2 ,} ponieważ może to zagrozić integralności proteomu mózgu.
2. Po rozwarstwieniu pokrój i przechowuj świeże tkanki w małych blokach (np. 5 mm x 5 mm), ponieważ ułatwia to bardziej wydajną homogenizację przed ekstrakcją amyloidu. Przenieś tkankę do sterylnej fiolki kriogenicznej, dokręć jej nakrętkę i szybko zanurz
.
3. Tkanki należy przechowywać zamrożone w bardzo niskich temperaturach (tj. -80 °C lub ciekły azot). Jeśli ekstrakcja ma być przeprowadzona kilka dni później, należy przechowywać tkanki w temperaturze -20 °C i unikać cykli zamrażania i rozmrażania. Rozmrozić zamrożone tkanki na mokrym lodzie, gdy są gotowe do ekstrakcji i oczyszczenia.
   nuta: Bezpośredni kontakt tkanek z ciekłym azotem może spowodować uszkodzenie tkanek i białek. Należy pamiętać, że kąpiel alkoholowa może usunąć trwałe markery z etykiet tubek.

2. Wzbogacanie materiału nierozpuszczalnego z dodecylosiarczanu sodu (SDS)

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki na lodzie i odwiruj w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Producenci i numery katalogowe chemikaliów i przyrządów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Zacznij od świeżo wypreparowanych lub zamrożonych obszarów tkanki mózgowej (rozmrożonych na lodzie) umieszczonych w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 6-8 kulek ceramicznych i świeżo przygotowanym lodowatym buforze homogenizacyjnym (1 ml na 0,25-1 g masy mokrej tkanki).
2. Przenieść probówki do homogenizatora młynka perełkowego i zmielić zawartość tkanki z prędkością 4000 obr./min, w dwóch cyklach po 30 s każdy i w odstępie 30 s pomiędzy nimi.
   nuta: Alternatywnie, do mielenia i homogenizacji tkanek można użyć zmotoryzowanych mieszadeł lub homogenizatorów.
3. Dodać 9 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego do 1 ml homogenatu całych tkanek mózgu w probówkach o pojemności 15 ml, uszczelnić paskami folii woskowej laboratorium i obracać od końca do końca przez noc w temperaturze 4 °C, aby zapewnić solidną rozpuszczalność.
   nuta: Aby usunąć niechciane duże resztki komórkowe i lipidy, następnego ranka należy wirować probówki w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zebrać supernatant w świeżej probówce. Zawiesić pozostały osad w 2 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego, dobrze wymieszać, ponownie wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C i połączyć oba supernatanty.
4. Powoli dodawać stałą sacharozę do zawiesiny ekstraktu tkankowego do końcowego stężenia 1,2 M, dobrze wymieszać i odwirować przy 250 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
5. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad w 2 ml buforu homogenizacyjnego zawierającego 1,9 M sacharozy przez triturację, a następnie odwirować przy 125 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
   nuta: Objętość bufora można dostosować w zależności od ilości materiału odzyskanego z poprzedniego etapu. Ogólnie rzecz biorąc, 10 objętości buforu homogenizacyjnego (V/V) jest idealne do tego etapu.
6. Zebrać górną białą warstwę stałą za pomocą pipety, przenieść ją do świeżej probówki i rozpuścić w 1 ml lodowatego buforu do mycia, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
7. Oprócz wierzchniej warstwy, granulka jest również wzbogacona w włókienka amyloidowe. Aby uzyskać wyższą wydajność, połącz dwie frakcje i kontynuuj. Ostrożnie usuń środkową warstwę wodną za pomocą pipety i wyrzuć.
8. Odwirować połączone frakcje przy 8000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
9. Dodać 1 ml lodowatego buforu do wytrawiania do przemytego osadu, ponownie zawiesić i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 godziny.
10. Wirować przy 8000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.
11. Ponownie zawiesić i przemyć (tak samo jak w kroku 2.8) strawione osady dwa razy w 1 ml lodowatego buforu Tris.
12. Zawiesić przemyty osad w 1 ml buforu do rozpuszczania zawierającego 1% SDS i 1,3 M sacharozy, pipetując w górę iw dół. Szybko wirować przy 200 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
    nuta: Chociaż fibryle amyloidowe są wysoce odporne na detergenty i denaturaty, bardzo długa ekspozycja na detergent (1% SDS) może wpłynąć na integralność włókienek lub usunąć ściśle związane białka, co zagrozi późniejszym analizom. Dlatego natychmiast po ponownym zawieszeniu granulek przystąp do wirowania.
13. Zachować osad i zwiększyć objętość pozostałego supernatantu przez dodanie 50 mM buforu Tris (w stosunku 1:0,3) w celu zmniejszenia stężenia sacharozy z 1,3 do 1 M i ponownie odwirować przy 200 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
14. Rozpuść dwa granulki w 100 μl buforu Tris zawierającego 0,5% SDS i połącz je w celu oczyszczenia z amyloidu. Widoczne granulki są małe i powinny wydawać się nieprzezroczyste i białawe (patrz rysunek 1A).

Wyniki

Rycina 1: Potwierdzenie ekstrakcji amyloidu za pomocą barwienia biochemicznego i obrazowania włókienek amyloidowych. (A) Wzbogacona, nierozpuszczalna osadka SDS zawierająca amyloid wydaje się nieprzezroczysta, w kolorze złamanej bieli. (B) Kongo czerwone zabarwienie rozpuszczalnego supernatantu SDS i nierozpuszczalnego osadu SDS zawierającego oczyszczony amyloid osu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Proteaza Inhibito	Thermo Scientific	164535	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Kolagenaza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C0130	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	11697498001	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Dnaza I	Thermo Fisher Naukowy	EN0521	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
K54 Silnik systemu homogenizacji tkanek	Cole'a Parmera	Glas-Col 099C	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Ultrawirówka Optima L-90K	Beckman Coulter	BR-8101P-E	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Homogenizator tkankowy Precellys 24	Instrumenty Bertin	P000062-PEVO0-A	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 74255	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Wirówka Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Naukowy	75002446	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów
Tris-HCl	Thermo Fisher Naukowy	15568025	Można stosować alternatywne instrumenty, chemikalia i przeciwciała innych producentów

powiedział: