Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe w celu analizy dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii w mózgu noworodka myszy

Streszczenie

Źródło: Kawasaki, H., et al. Inmózgowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusa i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje proces wstrzykiwania do komory mózgowej w celu zbadania dystrybucji mysiego wirusa cytomegalii (MCMV) w mózgu noworodka myszy. MCMV, zaprojektowany do ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) zapewniającego widoczność, jest wstrzykiwany do bocznej komory mózgu szczeniaka myszy. Wstrzyknięty wirus krąży w płynie mózgowo-rdzeniowym, infekując komórki w okolicy okołokomorowej, w tym w strefie brzeżnej, splocie naczyniówkowym i strefie podkomorowej.

Protokół

1. Wstrzyknięcie ICV MCMV i mikrogranulek fluorescencyjnych nowonarodzonym myszom

1. Utrzymuj normalne ciężarne myszy ICR w obiekcie o kontrolowanej temperaturze w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Noworodki oznaczane są jako P 0,5 w dniu urodzenia.
2. Wysterylizuj strzykawkę 10 μl i igłę 27 G 70% alkoholem.
3. Umieścić roztwór do wstrzykiwań (5 μl) zawierający MCMV lub mikrogranulki fluorescencyjne do igły, ostrożnie pociągając za tłok strzykawki.
4. Unieruchomić noworodka myszy (P 0,5), kładąc ją na lodzie na 3 - 4 minuty. Gdy zwierzę znajdzie się pod narkozą, użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia.
5. Oznaczyć miejsce wstrzyknięcia nietoksycznym pisakiem laboratoryjnym w miejscu około 0,7 - 1,0 mm po bokach szwu strzałkowego i 0,7 - 1,0 mm ogonowo od węzła noworodka (ryc. 1A).
6. Wprowadzić igłę na głębokość 2 mm, prostopadle do powierzchni czaszki w zaznaczonym miejscu wstrzyknięcia. Dla porównania, zaznacz 2 mm od końcówki igły nietoksycznym maszyną.
7. Powoli wstrzyknąć 5 μl MCMV (około 5 × 10⁵ PFU) do komory bocznej bez otwierania skóry głowy (ryc. 1B).
8. Innej grupie myszy wstrzyknąć 5 μl roztworu zawierającego mikrogranulki fluorescencyjne (0,1 - 0,3 μm, około 5,75 × 10⁸ cząstek) tą samą metodą.
9. Powoli wyjmować igłę 10 - 20 sekund po zaprzestaniu ruchu tłoka, aby zapobiec cofaniu się igły.
10. Aby wyzdrowieć, trzymaj myszy przez 5-10 minut w ciepłym pojemniku, aż ruch i ogólna reakcja zostaną przywrócone.
11. Zbierz mózgi w różnych punktach czasowych (3, 12, 24, 48 i 72 godziny) po wstrzyknięciu.

Wyniki

Rycina 1: Miejsca wstrzyknięcia nowonarodzonej myszy. (A, B) Wstrzyknięcie ICV 5 μl MCMV (około 5 × 10⁵ PFU) lub 5 μl mikrogranulek (około 5,75 × 10⁹ cząstek). (A) Miejsce wstrzyknięcia znajduje się w punkcie środkowym między uchem a okiem (w miejscu około 0,7 - 1,0 mm bocznie od szwu strzałkowego i 0,7 - 1,0 mm ogonowo od węzła noworodka). (B)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SPHERO TM Polistyren fluorescencyjny Czerwień Nilowa 0,04-0,06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Polistyren fluorescencyjny Czerwień Nilowa 0,1-0,3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Polistyren fluorescencyjny Czerwień Nilowa 1,7-2,2	Spherotech, spółka z o.o.	FP-2056-2
10% serum dla myszy	DAKO	Zobacz materiał X0910
Mysz C57BL/6	SLC, Inc.
Mysz ICR	SLC, Inc.
Zmodyfikowane strzykawki mikrolitrowe (seria 7000)	Firma Hamilton
Igła o rozmiarze 35	Saito Medyczny
Wektor pEGFP-N1	Clontech	#6085-1