Ocena odpowiedzi interneuronów na chemoatrakcyjne sygnały z komórek śródbłonka okołokomorowego

Streszczenie

Źródło: Datta, D., et al. Migracja, chemo-przyciąganie i testy kohodowli dla ludzkich komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje metodę testowania migracji między neuronami w odpowiedzi na chemoatrakcyjne sygnały z okołokomorowych komórek śródbłonka (PVEC). Interneurony są umieszczone w centralnym pomieszczeniu, z PVEC i komórkami kontrolnymi po obu stronach. Zwiększona migracja w kierunku PVEC wskazuje na pozytywną reakcję na ich chemoatrakcyjne sygnały.

Protokół

1. Test przyciągania chemicznego

1. Umieść trzydołkową wkładkę hodowlaną na środku naczynia o średnicy 35 mm pokrytego poli-L-ornityną/lamininą za pomocą sterylnej pęsety.
2. Odwróć naczynie do góry nogami. Zaznacz granicę wokół środkowej komory wkładu za pomocą trwałego czarnego markera z ultracienką końcówką.
3. Nasiona 3 x 10⁴ ludzkie interneurony GABA-ergiczne w środkowym przedziale w 70 μl pożywki neuronalnej (ryc. 1A).
4. Nasiona 10⁴ ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego w 70 μl pożywki dla komórek śródbłonka okołokomorowego i 10⁴ komórki śródbłonka kontrolnego w 70 μl pożywki dla komórek śródbłonka w dwóch zewnętrznych przedziałach odpowiednio (ryc. 1A).
5. Dodaj 1 ml pożywki do kohodowli (50% pożywki okołokomorowej bez GABA i 50% pożywki neuronalnej) wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec wysychaniu powłoki na szalce.
6. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nie wyciekają z komory wkładki.
7. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po 24 godzinach inkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są prawidłowo przyczepione i czy nie ma wycieku.
8. Po 48 godzinach od wysiewu delikatnie wyjąć wkładkę za pomocą sterylnej pęsety. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że warstwa komórkowa nie jest naruszona (dzień 0).
9. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki do współhodowli.
   UWAGA: Odłóż na bok wymaganą liczbę potraw na zdjęcia dnia 0.
10. Inkubować komórki przez 36 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po 36 godzinach odessać pożywkę, utrwalić komórki 4% PFA przez 10 min i przemyć 3x 1x PBS.
11. Zabarwić ludzkie interneurony GABA-ergiczne anty-ludzką β-tubuliną lub przeciwciałem anty-ludzkim MAP2. Pod koniec procedury barwienia dodaj 1 ml pożywki do klejenia zapobiegającego blaknięciu do każdego naczynia.

2. Obrazowanie i analiza danych

1. Umieść wybarwioną immunologicznie szalkę testową pod mikroskopem pod 4-krotnym powiększeniem.
2. Zachowaj jedną długą krawędź prostokątnej granicy (wykonaną w kroku 5.10 powyżej) w polu widzenia. Zrób zdjęcia komórek w wolnej od komórek przestrzeni przylegającej do tej granicy. Obrazy można wykonywać wzdłuż prawej długiej krawędzi i lewej długiej krawędzi prostokątnej granicy.
   UWAGA: Komórki umieszczone po przekątnej w stosunku do prostokąta nie są brane pod uwagę ze względu na niejednoznaczność w wyborze krótkiej lub długiej krawędzi jako znacznika początkowego. Ponadto liczba komórek migrujących przez krótszą krawędź jest często znacznie mniejsza (prawdopodobnie z powodu mniejszej liczby komórek początkowych wzdłuż krótkiej krawędzi) i nie jest brana pod uwagę.
3. Otwórz obrazy w ImageJ. Oblicz odległość między każdą komórką a znacznikiem granicy za pomocą ImageJ.
4. Aby ocenić migrację pod względem liczby komórek, ustaw określoną odległość od granicy na pozyskanym obrazie w ImageJ. Policz liczbę komórek, które znajdują się w tej odległości. Oblicz średnią liczbę, standardowe devia
5. i istotności statystycznej za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Wyniki

Rysunek 1: Test przyciągania chemicznego. (A) Schemat testu przyciągania chemicznego. Za pomocą trzydołkowej wkładki hodowlanej, interneurony (IN) zostały wysiane w środku (zielony prostokąt kropkowany), podczas gdy komórki śródbłonka okołokomorowego (PV EC; pomarańczowy prostokąt kropkowany) i komórki śródbłonka kontrolnego (EC; żółty prostokąt kropkowany) zostały wysiane po obu stronach. (B) Obraz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kontroluj ludzkie komórki śródbłonka	Dynamika komórkowa	Czynnik R1022
Kontroluj komórki śródbłonka Średni suplement	Dynamika komórkowa	Zobacz materiał M1019
DMEMF/12 średni	Thermofisher Naukowy	11320033
E6 średni	Thermofisher Naukowy	A1516401
FGF2	Thermofisher Naukowy	PHG0261
Fibronektyna	Thermofisher Naukowy	Nr kat. 33016-015
GABA (Księga GABA	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2129
Hemacytometr	Sigma-Aldrich	Z359629
Ludzkie neurony GABA-ergiczne	Dynamika komórkowa	Czynnik R1013
Pożywka podstawowa dla ludzkich neuronów GABA-ergicznych	Dynamika komórkowa	Zobacz materiał M1010
Ludzki neuron GABA-ergiczny Suplement neuronowy	Dynamika komórkowa	Zobacz materiał M1032
Laminina	Sigma	L2020
Medium montażowe	Laboratoria wektorowe	H-1200
poli-L-ornityna	Sigma	Zobacz materiał p4957
Pbs	Thermofisher Naukowy	Numer katalogowy: 14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Kompletny zestaw	Technologie ogniw Lifeline	LL-0003	Składnik pożywki kontrolnej dla ludzkich komórek śródbłonka
3-dołkowa wkładka do hodowli silikonowej	ibidi	Numer katalogowy: 80369
Czasza 35 mm	Corning	430165
4% roztwór PFA	Fisher Naukowy	AAJ19943K2
Mikroskop z odwróconą fazą kontrastu	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	FSX-100
Przeciwciało przeciwko ludzkiej β-tubulinie	Legenda biologiczna	802001
Przeciwciało anty-MAP2	Neuromika	CH22103