Immunoprecypitacja docelowych kompleksów białko-DNA z lizatu neuronu ruchowego

Streszczenie

Źródło: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Wysokorozdzielcze mapowanie interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny-egzonukleazy (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje immunoprecypitację fragmentów DNA usieciowanych z białkiem docelowym z lizatów neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego.

Protokół

UWAGA: Autoklawowana woda destylowana i dejonizowana (ddH₂O) jest zalecana do tworzenia i głównych mieszanek reakcji.

1. Zbieranie i sieciowanie komórek

1. Po różnicowaniu mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES) w neurony postmitotyczne, dodaj 11% formaldehydu do pobranych komórek do końcowego stężenia 1% (v/v). Komórki skalne na platformie kołyszącej (kołysce, wytrząsarce lub rotatorze) przez 15 minut, w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C).
   nuta: W zależności od białka docelowego, które ma być usieciowane, można zastosować mniej sieciowania formaldehydu (n....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza, UltraPure	Invitrogen	16500	Sprawdzanie sonikacji (Sekcja 4.3.6)
Albumina, Surowica bydlęca (BSA), Bez proteazy, izolacja szoku cieplnego, min. 98%	Sklep BioShop	ALB003	Rozwiązanie blokujące
Przeciwciało przeciwko Isl1	Magazyn DSHB	39,3F7	Inkuacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenoda	B01060010	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.3)
Wirówka 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.5), kontrola sonikacji (sekcja 4.3.1, 4.3.3 i 4.3.4)
Wirówka 5804 R	Eppendorf	22623508	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3), liza komórek (sekcja 2.2 i 2.3), sonikacja chromatyny (sekcja 3.1)
Kompletny, mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy	Roche	4693159001	Dodawany do wszystkich, z wyjątkiem buforu proteinazy K i buforu elucji ChIP
Sól sodowa kwasu deoksycholowego	Fisher Scientific	Zobacz materiał BP349	Bufor do lizy 3, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i bufor do płukania LiCl
EDTA, 0,5 m, sterylny roztwór, pH 8,0	Sklep BioShop	Zobacz materiał EDT111	Bufor do lizy 1-3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl i bufor elucyjny ChIP
Alkohol etylowy bezwodny, 100%	Alkohole komercyjne	P006EAAN	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
Formaldehyd, 36,5-38%, zawiera 10-15% metanolu	Sigma	F8775	Komórki do zbierania, sieciowania i zamrażania (sekcja 1.1)
Glicerol, klasa odczynnika, min 99.5%	Sklep BioShop	GLY002	Bufor do lizy 1
Glicyna, klasa biotechnologiczna, min. 99%	Sklep BioShop	GLN001	Komórki do zbierania, sieciowania i zamrażania (sekcja 1.2)
Glikogen, klasa RNA	Thermo Scientific	Czynnik R0551	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
HEPES, 1 M sterylnie przefiltrowany roztwór, pH 7,3	Sklep BioShop	HEP003	Bufor do lizy 1, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Chlorek litu (LiCl), klasa odczynnika	Sklep biologiczny	LIT704	Bufor płuczący LiCl
Kulki magnetyczne do ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)	Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)	Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5)
Stojak magnetyczny (DynaMag-2 Magnet)	Invitrogen	Numer katalogowy 12321D	Używany w wielu krokach w sekcjach: 5
N-lauroilosarkozyna, roztwór soli wodnej, 30% roztwór wodny, ≥97,0% (HPLC)	Sigma	Numer katalogowy: 61747	Bufor do lizy 3
Etoksylowany oktylofenol (IGEPAL CA630)	Sklep BioShop	NON999	Bufor do lizy 1 i bufor do płukania LiCl
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy, klasa biotechnologiczna (25:24:1)	Sklep BioShop	PHE512	Sprawdzanie sonikacji (Sekcja 4.3.1)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x	Corning	21040CV	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3) i chromatyna sonikująca (sekcja 3.1), inkuacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.1)
Podstawowy zasilacz PowerPac	Przedsiębiorstwo BioRad	1645050	Sprawdzanie sonikacji (Sekcja 4.3.6)
Roztwór proteinazy K, klasa RNA	Invitrogen	25530049	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.2)
Wolne od rnazy A, Dnazy i proteazy	Thermo Scientific	EN0531	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.2)
Chlorek sodu (NaCl), BioReagent	Sigma	Zobacz materiał S5886	Bufor do lizy 1-3, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Dodecylosiarczan sodu (SDS), stopień elektroforezy	Sklep BioShop	Zobacz materiał SDS001	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli i buforu elucyjnego ChIP
Koraliki soniczne i probówki Bioruptor 15 ml	Diagenoda	C01020031	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.1 i 3.2)
Mieszalnik termiczny F1.5	Eppendorf	5384000020	Sekcja 4.2, 4.3.2 i 4.3.5
Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 7,4	Sigma	Zobacz materiał T2194	Bufor 10 mM Tris-HCl
Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 8,0	Sigma	Zobacz materiał T2694	Bufor do lizy 2, bufor do lizy 3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor płuczący LiCl i bufor elucyjny ChIP
VWR Mini Tube Rocker, zmienna prędkość	Firma VWR	Numer katalogowy: 10159-752	Używany w wielu krokach w sekcjach: 1, 2, 5, 6 i 7
2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol, Triton X-100, klasa odczynnika	Sklep BioShop	TRX506	Bufor do lizy 1, chromatyna sonikująca (sekcja 3.4) i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli

szt. powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: TGL