Immunoprecypitacja docelowych kompleksów białko-DNA z lizatu neuronu ruchowego

Streszczenie

Źródło: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Wysokorozdzielcze mapowanie interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny-egzonukleazy (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje immunoprecypitację fragmentów DNA usieciowanych z białkiem docelowym z lizatów neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego.

Protokół

UWAGA: Autoklawowana woda destylowana i dejonizowana (ddH₂O) jest zalecana do tworzenia i głównych mieszanek reakcji.

1. Zbieranie i sieciowanie komórek

1. Po różnicowaniu mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES) w neurony postmitotyczne, dodaj 11% formaldehydu do pobranych komórek do końcowego stężenia 1% (v/v). Komórki skalne na platformie kołyszącej (kołysce, wytrząsarce lub rotatorze) przez 15 minut, w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C).
   nuta: W zależności od białka docelowego, które ma być usieciowane, można zastosować mniej sieciowania formaldehydu (na przykład stężenie końcowe 0,5%) lub podwójne sieciowanie glutaranem disuccinimidylu (DSG).
2. Dodać 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 150 mM, aby zatrzymać reakcję sieciowania. Skalne komory na bujanej platformie przy dużym natężeniu ruchu, przez 5 min.
3. Odwirować usieciowane komórki w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej, przez 6 minut, przy 1 350 x g. Odessać roztwór, a następnie ponownie zawiesić komórki w 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   nuta: Usieciowane granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu ciekłym azotem.

2. Liza komórek

UWAGA: Poniższe kroki w tym protokole dotyczą około 2 x 10⁷ komórek neuronalnych zróżnicowanych z mysich komórek ES. Aby rozbić otwarte komórki, zostaną użyte do lizy zawierające różne detergenty. Dodaj 50 μl 1000x kompletnego inhibitora proteazy (CPI) do 50 ml buforu tuż przed użyciem.

1. Przygotować do lizy 1−3 zgodnie z opisem w tabeli 1.
2. Rozmrozić usieciowane granulki komórkowe na lodzie, a następnie dokładnie zawiesić granulki komórkowe w 3 ml buforu do lizy 1 na 15 ml stożkowych probówek. Kołysz się w temperaturze 4 °C przez 15 minut na bujanej platformie. Wirować przy 1,350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odsysać supernatant.
3. Dokładnie zawiesić granulowane komórki w 3 ml buforu do lizy 2. Kołysz się w temperaturze 4 °C przez 10 minut na bujanej platformie. Wirować przy 1,350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odsysać supernatant.
4. Dodaj 1 ml buforu do lizy 3 do każdej granulki, a następnie trzymaj na lodzie. Natychmiast przystąp do sonikacji.

3. Sonikacja chromatyny

UWAGA: Trzymaj próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C podczas tej procedury sonikacji, aby zmniejszyć odwrócenie sieciowania.

1. Za pomocą sterylnej szpatułki dodaj koraliki sonikacyjne (Tabela materiałów) do kreski podziałki 0,2 ml na rurkach z polistyrenu o pojemności 15 ml. Umyj kulki sonikacyjne poprzez wirowanie w 600 μL 1x PBS, aż nie będą widoczne suche plamy. Wirować probówki przez 5 s przy 30 x g i odssać 1x PBS.
   nuta: Sonikacja w rurkach polistyrenowych jest bardziej efektywna niż sonikacja w rurkach polipropylenowych. Jeśli mniejsza liczba komórek (na przykład <10⁶ komórek) jest poddawana sonikacji, należy użyć probówek polistyrenowych o pojemności 1,5 ml bez dodawania kulek sonikacyjnych.
2. Dokładnie zawiesić lizaty jądrowe w 1 ml buforu do lizy 3 (od kroku 2.4), a następnie przenieść do probówek polistyrenowych o pojemności 15 ml zawierających kulki sonikacyjne. Krótko wymieszaj rurki styropianowe.
3. Aby rozdrobnić usieciowane DNA chromatyny, należy poddać sonikacji lizaty jądrowe w temperaturze 4 °C przez zoptymalizowaną liczbę cykli, z amplitudą mocy 30 W i cyklami sonikacji ustawionymi na 30 s wł.
   nuta: Optymalizacja sonikacji dla każdego typu komórki i partii zaowocuje najlepszą wydajnością immunoprecypitacji i egzonukleazy chromatyny (ChIP-exo). W przypadku komórek neuronalnych myszy 2 x 10⁷ 20−30 cykli sonikacji przy wymienionych ustawieniach spowoduje fragmentację chromatyny w zakresie 100−500 pz.
4. Po zakończeniu sonikacji przenieść cały supernatant (sonikowane lizaty) z każdej próbki do probówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanolu) do każdej próbki w końcowym stężeniu 1%. Wymieszać pipetując.
5. Aby osadzać resztki komórek, należy odwirować próbki o masie 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść wszystkie sonikowane lizaty (supernatant) z każdej próbki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
6. Weź 30 μl sonikowanego lizatu z każdej próbki (~3% sonikowanego lizatu) i dodaj do nowych probówek o pojemności 1,5 ml, aby sprawdzić sonikację. Pozostałe sonikowane lizaty przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do inkubacji z kulkami pokrytymi przeciwciałami.

4. Sprawdzanie sonikacji

1. Przygotuj 20 ml buforu 2x proteinazy K, dodając 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 10 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 6 ml autoklawizowanego ddH₂O. Nie dodawaj CPI do tego bufora. Przechowywać w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.
2. Aby odwrócić usieciowanie białko-DNA, poprzez usunięcie białek, należy pobrać 30 μl sonikowanej chromatyny z każdej próbki (z kroku 3.6), dodać 166 μL autoklawizowanego ddH₂O, 200 μL buforu 2x proteinazy K i 4 μL 20 mg/ml proteinazy K. Krótko zawirować próbki, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez 1-3 godziny przy 24 x g.
3. UWAGA: Sonikowane lizaty mogą być sieciowane wstecznie w temperaturze 65 °C przez noc.
4. Ekstrahować DNA za pomocą fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (PCIA: 25:24:1) i metody wytrącania etanolu w następujący sposób.
   ostrożność: PCIA jest toksyczna. Stosować pod wyciągiem wyciągowym ze standardowymi środkami ochrony osobistej (PPE).
   1. Dodać 400 μl PCIA do każdej próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml, ustawić wir na maksymalną prędkość i wirować próbki przez 20 s. Wirować przy 18 400 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Obserwowane będą dwie fazy. Ostrożnie przenieść górną warstwę wodną (przezroczystą fazę) każdej próbki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
   2. Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   3. Dodać 1 μl glikogenu 20 mg/ml do każdej próbki, a następnie wytłoć 1 ml lodowatego 100% etanolu (przechowywanego w zamrażarce o temperaturze -20 °C). Krótko wymieszać, a następnie inkubować próbki w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 30 minut do 1 godziny. Odwirować próbki o masie 18 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie wylać 100% etanol.
   4. Umyj granulki 500 μl lodowatego 70% etanolu (przechowywanego w zamrażarce o temperaturze -20 °C). Wirować przy 18 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wylać 70% etanolu.
   5. Próbki należy inkubować w probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze 50 °C, aż do odparowania pozostałego etanolu. Zawiesić granulki DNA w 15 μl autoklawizowanego ddH2O lub ddH2O wolnego od nukleazy.
   6. Uruchom wyekstrahowane próbki DNA, wraz z drabinką DNA, w 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120−180 V i sprawdź rozmiar sonizowanego DNA.

5. Inkubacja przeciwciał z koralikami

UWAGA: Poniższe kroki w tym protokole dotyczą około 2 x 10⁷ komórek neuronalnych zróżnicowanych z mysich komórek ES. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj kulek magnetycznych w żadnym momencie protokołu ChIP-exo, ponieważ kulki mogą pęknąć, powodując zanieczyszczenie próbki lub działanie przeciwciała może być zagrożone.

1. Po lizie komórek i sonikacji przygotuj kulki magnetyczne białka G (tabela materiałów) dla ChIP, wymieszaj kulki magnetyczne do uzyskania jednorodności, a następnie dodaj 25 μl kulek magnetycznych do 2 ml probówek białkowych o niskim wiązaniu.
   UWAGA: Rodzaj użytych kulek magnetycznych będzie zależał od gatunku przeciwciał.
2. Umyj koraliki 1 ml roztworu blokującego (tabela 1), dobrze wymieszaj, a następnie umieść na ruszcie magnetycznym na 1 minutę. Będąc jeszcze na stojaku magnetycznym, usuń supernatant, gdy będzie czysty.
3. Dodaj 1 ml roztworu blokującego do kulek magnetycznych. Rury skalne przez 10 minut w temperaturze 4 °C na platformie bujanej. Krótko zakręć, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
4. Powtórz krok 5.3 jeszcze dwa razy.
5. Dodaj 500 μl roztworu blokującego do kulek magnetycznych. Krótko odkręć przeciwciało przeciwko Isl1 (0,04 μg/μL, tabela materiałów), a następnie dodaj 4 μg przeciwciała do odpowiednich 2 ml probówek białkowych o niskim poziomie wiązania zawierających kulki magnetyczne w roztworze blokującym.
6. Powtórzyć krok 5.5 bez przeciwciała (tj. kontrola bez przeciwciał dla ChIP).
   nuta: Ilość przeciwciała, które należy dodać, można określić empirycznie, biorąc pod uwagę jakość przeciwciała i liczbę komórek użytych do ChIP.
7. Próbki skał w temperaturze 4 °C przez 6−24 h na platformie bujanej.

6. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

1. Przemyć kulki pokryte przeciwciałami z kroku 5.8 1 ml roztworu blokującego. Umieścić próbki na platformie bujanej w temperaturze 4 °C na 5 minut. Usunąć supernatant.
2. Powtórz krok 6.1 jeszcze dwa razy.
3. Ponownie zawiesić kulki pokryte przeciwciałami w 50 μl roztworu blokującego, a następnie przenieść do nowych probówek o niskiej zawartości białka o pojemności 2 ml. Do każdej próbki ChIP dodać sonikowane lizaty (~1,0 ml z kroku 3.6) do kulek pokrytych przeciwciałami w probówkach o niskim poziomie wiązania białka o pojemności 2 ml.
4. Każdą próbkę inkubować na platformie kołyszącej przez noc w temperaturze 4 °C.

7. ChIP myje

UWAGA: Przechowuj próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby utrzymać sieciowanie białko-DNA podczas mycia ChIP.

1. Przygotować bufor do przemywania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl i 10 mM bufor Tris-HCl (pH 7,4), jak opisano w tabeli 2. Przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. Dodać 50 μl zapasu 1000x CPI do wszystkich tuż przed użyciem.
2. Krótko odwiruj próbki w probówkach o pojemności 2 ml o niskim poziomie wiązania białka, aby zebrać płyn z nakrętek, a następnie umieść je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety.
3. W przypadku przemywania ChIP dodać 1 ml buforu do lizy 3 (w temperaturze 4 °C) do każdej probówki. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
4. Dodaj 1 ml zimnego buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do każdej probówki. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
5. Do każdej probówki dodać 1 ml zimnego buforu do płukania LiCl. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
6. Dodać 1 ml zimnego 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,4) do każdej probówki. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
   nuta: Bufor Tris-EDTA (pH 8,0) może być stosowany zamiast buforu Tris-HCl (pH 7,4).

Tabela 1: Przepisy na do lizy 1−3 i bufor blokujący. Przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 50 μl 1000x CPI (kompletny inhibitor proteazy) do wszystkich.

pkt.

Bufor do lizy 1
Odczynnik	Objętość (ml)	[Finał]
1 M KRWIONOŚ (pH 7,3)	Rozdział 2.5	50 mM
5 M NaCl	1.4	140 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
50% glicerolu	10	10%
10% etoksylowany oktylofenol	Rozdział 2.5	0,50%
10% 2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol	Wydanie orzeczenia 1,25	0.25%
Autoklawizowane ddH2O	Napełnienie do 50
Bufor do lizy 2
Odczynnik	Objętość (ml)	[Finał]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	1	10 mM
5 M NaCl	cyfra arabska	200 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
Autoklawizowane ddH2O	Napełnienie do 50
Bufor do lizy 3
Odczynnik	Objętość (ml)	[Finał]
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	0,5	10 mM
5 M NaCl	1	100 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% kwas dezoksycholowy	0,5	0,10%
30% roztwór soli sodowej N-lauroilosarkozyny	0,83	0,50%
Autoklawizowane ddH2O	Napełnienie do 50
Rozwiązanie blokujące
Odczynnik	kwota	[Finał]
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	250 mg tabletki powlekania	0,50%
Kompletny inhibitor proteazy (CPI, 1000x)	50 μL	1x
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Napełnij do 50 ml

Tabela 2: Przepisy na płukanie ChIP: bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl i bufor 10 mM Tris-HCl (pH 7,4). Przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. Dodać 50 μl zapasu 1000x CPI do wszystkich tuż przed użyciem.

.

Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Odczynnik	Objętość (ml)	[Finał]
1 M KRWIONOŚ (pH 7,3)	Rozdział 2.5	50 mM
5 M NaCl	5	500 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% 2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol	5	1 proc
5% Kwas dezoksycholowy	1	0,10%
5% SDS	1	0,10%
Autoklawizowane ddH2O	Napełnienie do 50
Bufor myjący LiCl
Odczynnik	Objętość (ml)	[Finał]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	cyfra arabska	20 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
1 M LiCl	Rozdział 12,5	250 mM
10% etoksylowany oktylofenol	Rozdział 2.5	0,50%
5% Kwas dezoksycholowy	5	0,50%
Autoklawizowane ddH2O	Napełnienie do 50
10 mM bufor Tris-HCl
Odczynnik	Objętość (ml)	[Finał]
1 M Tris-HCl (pH 7,4)	0,5	10 mM
Autoklawizowane ddH2O	Napełnienie do 50

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza, UltraPure	Invitrogen	16500	Sprawdzanie sonikacji (Sekcja 4.3.6)
Albumina, Surowica bydlęca (BSA), Bez proteazy, izolacja szoku cieplnego, min. 98%	Sklep BioShop	ALB003	Rozwiązanie blokujące
Przeciwciało przeciwko Isl1	Magazyn DSHB	39,3F7	Inkuacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenoda	B01060010	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.3)
Wirówka 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.5), kontrola sonikacji (sekcja 4.3.1, 4.3.3 i 4.3.4)
Wirówka 5804 R	Eppendorf	22623508	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3), liza komórek (sekcja 2.2 i 2.3), sonikacja chromatyny (sekcja 3.1)
Kompletny, mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy	Roche	4693159001	Dodawany do wszystkich, z wyjątkiem buforu proteinazy K i buforu elucji ChIP
Sól sodowa kwasu deoksycholowego	Fisher Scientific	Zobacz materiał BP349	Bufor do lizy 3, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i bufor do płukania LiCl
EDTA, 0,5 m, sterylny roztwór, pH 8,0	Sklep BioShop	Zobacz materiał EDT111	Bufor do lizy 1-3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl i bufor elucyjny ChIP
Alkohol etylowy bezwodny, 100%	Alkohole komercyjne	P006EAAN	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
Formaldehyd, 36,5-38%, zawiera 10-15% metanolu	Sigma	F8775	Komórki do zbierania, sieciowania i zamrażania (sekcja 1.1)
Glicerol, klasa odczynnika, min 99.5%	Sklep BioShop	GLY002	Bufor do lizy 1
Glicyna, klasa biotechnologiczna, min. 99%	Sklep BioShop	GLN001	Komórki do zbierania, sieciowania i zamrażania (sekcja 1.2)
Glikogen, klasa RNA	Thermo Scientific	Czynnik R0551	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
HEPES, 1 M sterylnie przefiltrowany roztwór, pH 7,3	Sklep BioShop	HEP003	Bufor do lizy 1, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Chlorek litu (LiCl), klasa odczynnika	Sklep biologiczny	LIT704	Bufor płuczący LiCl
Kulki magnetyczne do ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)	Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)	Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5)
Stojak magnetyczny (DynaMag-2 Magnet)	Invitrogen	Numer katalogowy 12321D	Używany w wielu krokach w sekcjach: 5
N-lauroilosarkozyna, roztwór soli wodnej, 30% roztwór wodny, ≥97,0% (HPLC)	Sigma	Numer katalogowy: 61747	Bufor do lizy 3
Etoksylowany oktylofenol (IGEPAL CA630)	Sklep BioShop	NON999	Bufor do lizy 1 i bufor do płukania LiCl
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy, klasa biotechnologiczna (25:24:1)	Sklep BioShop	PHE512	Sprawdzanie sonikacji (Sekcja 4.3.1)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x	Corning	21040CV	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3) i chromatyna sonikująca (sekcja 3.1), inkuacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.1)
Podstawowy zasilacz PowerPac	Przedsiębiorstwo BioRad	1645050	Sprawdzanie sonikacji (Sekcja 4.3.6)
Roztwór proteinazy K, klasa RNA	Invitrogen	25530049	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.2)
Wolne od rnazy A, Dnazy i proteazy	Thermo Scientific	EN0531	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.2)
Chlorek sodu (NaCl), BioReagent	Sigma	Zobacz materiał S5886	Bufor do lizy 1-3, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Dodecylosiarczan sodu (SDS), stopień elektroforezy	Sklep BioShop	Zobacz materiał SDS001	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli i buforu elucyjnego ChIP
Koraliki soniczne i probówki Bioruptor 15 ml	Diagenoda	C01020031	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.1 i 3.2)
Mieszalnik termiczny F1.5	Eppendorf	5384000020	Sekcja 4.2, 4.3.2 i 4.3.5
Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 7,4	Sigma	Zobacz materiał T2194	Bufor 10 mM Tris-HCl
Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 8,0	Sigma	Zobacz materiał T2694	Bufor do lizy 2, bufor do lizy 3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor płuczący LiCl i bufor elucyjny ChIP
VWR Mini Tube Rocker, zmienna prędkość	Firma VWR	Numer katalogowy: 10159-752	Używany w wielu krokach w sekcjach: 1, 2, 5, 6 i 7
2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol, Triton X-100, klasa odczynnika	Sklep BioShop	TRX506	Bufor do lizy 1, chromatyna sonikująca (sekcja 3.4) i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli

szt. powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: TGL