Barwienie immunologiczne fluorescencyjne wycinków organoidów móżdżku

Streszczenie

Źródło: Silva, T. P., et al., Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne wycinków organoidów móżdżku w celu identyfikacji specyficznych antygenów docelowych wyrażanych w różnych neuronach móżdżku, które wskazują na dojrzewanie organoidów.

Protokół

1. Barwienie immunologiczne wycinków organoidów

1. Umieść szkiełka mikroskopowe zawierające skrawki organoidów w słoiku do kopiowania z 50 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS, przechowując do 10 szkiełek tyłem do siebie.
   nuta: Wszystkie skrawki organoidów należy zanurzyć w cieczy.
2. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C w celu odżelatynizacji szkiełek.
3. Płukać 1x 50 ml 1× PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej: Przenieś szkiełka do słoika zawierającego świeże 1× PBS.
4. Przenieść szkiełka do słoika zawierającego 50 ml świeżo przygotowanej glicyny (tabela 1) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przenieść szkiełka do słoika zawierającego 50 ml 0,1% trytonu (Tabela 1) i przepuszczać przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Myć 1× PBS przez 5 min 2x.
7. Przygotuj naczynie do barwienia immunologicznego z papieru o grubości 3 mm nasączonego 1× PBS. Osusz szkiełka chusteczką wokół plastrów i ułóż je na papierze o grubości 3 mm. Za pomocą pipety Pasteura pokryć całą powierzchnię szkiełek roztworem blokującym (Tabela 1), 0,5 ml na szkiełko. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Usuń nadmiar roztworu blokującego i osusz szkiełka chusteczką wokół plastrów. Umieścić 50 μl przeciwciała pierwszorzędowego (tabela 2) rozcieńczonego w roztworze blokującym na skrawkach i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Umieść plastry w przygotowanym wcześniej naczyniu do barwienia immunologicznego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
9. Przenieś szkiełka do słoika z 50 ml TBST (Tabela 1), pozwól szkiełkom opaść i myj TBST przez 5 minut 3x.
10. Umieścić 50 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym na skrawkach i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Umieść plastry we wcześniej przygotowanym naczyniu do barwienia immunologicznego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
11. Przenieś szkiełka ponownie do słoika do kopiowania i myj 50 ml TBST przez 5 minut 3x.
12. Osusz szkiełka chusteczką wokół plastrów i umieść plastry we wcześniej przygotowanym naczyniu do barwienia immunologicznego. Za pomocą pipety Pasteura dodaj 0,5 ml roztworu DAPI na całą powierzchnię szkiełek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
13. Powtórz krok 1.9.
14. Ostrożnie osusz szkiełka chusteczką. Stopniowo dodawaj 50 μl podłoża montażowego wzdłuż szkiełka, a następnie ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na każde szkiełko, lekko je zginając, aby uniknąć pęcherzyków.

Tabela 1: Roztwory do przygotowania organoidów do kriosekcji i barwienia immunologicznego. Wymieniono wszystkie składniki i objętości używane do przygotowania roztworów stosowanych do przygotowania organoidów do kriosekcji i barwienia immunologicznego.

Żelatyna/sacharoza Stężenie końcowe: 7,5%/15% w/w	1. Zważ 15 g sacharozy i 7,5 g żelatyny w sterylnej szklanej butelce Schott i dobrze wymieszaj 2. Podgrzej PBS 1x w temperaturze 65 °C 3. Dodaj podgrzany PBS 1x do końcowej masy 100 g i dobrze wymieszaj 4. Umieść szklaną butelkę Schott na płycie grzewczej o temperaturze 65 °C i potrząsaj, aż żelatyna się rozpuści 5. Inkubować w temperaturze 37 °C do momentu ustabilizowania się roztworu
Glicyna Stężenie końcowe: 0,1 M	Dodaj 0,37 g glicyny do 50 ml świeżo przygotowanego PBS 1x.
Roztwór Triton Stężenie końcowe: 0,1 % w/v	1. Przygotować 10 % wywar Triton X-100: 5 g Triton X-100 w 50 ml PBS 1x 2. Dodaj 0,5 ml bulionu Triton X-100 do 50 ml PBS 1x.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % w/v Tween-20	20 ml Tris 1 M 30 ml NaCl 5 M 5 ml Tween-20 (10 % bulionu: 5 g Tween-20 w 50 ml wody) Napełnij do 1 l wodą.
Rozwiązanie blokujące	Dodać 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, stężenie końcowe: 10 % v/v) do 50 ml TBST.
Rozwiązanie DAPI	Dodać 15 μl roztworu podstawowego DAPI (1 mg/ml) do 10 ml wody destylowanej
Mówił	1. Dodać 2,4 g Mowiolu do 6 g glicerolu i wstrząsać przez 1 godzinę na podgrzanym talerzu w temperaturze 50 °C 2. Dodaj 6 ml wody destylowanej i wstrząsaj przez 2 godziny 3. Dodaj 12 ml Tris 200 mM (pH 8,5) i wstrząsaj przez 10 min 4. Wirować przy 5 000 × g przez 15 minut5. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 2: Przeciwciała pierwszorzędowe. Wymieniono podstawowe przeciwciała, klony i zoptymalizowane rozcieńczenia stosowane do barwienia immunologicznego.

powiedział: szt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. główna) szt. powiedział: powiedział: powiedział: szt.

przeciwciało	Gatunki żywicielskie	Rozcieńczeniu
BARHL1	królik	1/500
KALBINDYNA	królik	1/500
MAP2	mysz	1/1000
N-CADHERIN	mysz	1/1000
NESTIN (Gniazdo)	mysz	1/400
OLIG2	królik	1/500
PAX6 (wersja	królik	1/400
Klasa SOX2	mysz	1/200
TBR1	królik	1/200
TBR2	królik	1/200
TUJ1	mysz	1/1000

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Papier 3MM	WHA3030861	Merck
Przeciwciało anty-BARHL1	HPA004809	Przeciwciała Atlasa
Przeciwciało anty-kalbindynowe D-28k	Zobacz materiał CB28	Milipory
Przeciwciało anty-MAP2	Zobacz materiał M4403	Sigma
Przeciwciało anty-N-kadheryny	610921	Transdukcja BD
Przeciwciało anty-NESTIN	MAB1259-SP	Prace badawczo-rozwojowe
Przeciwciało anty-OLIG2	MABN50	Milipory
Przeciwciało anty-PAX6	PRB-278P	Covance (Kot)
Przeciwciało anty-SOX2	MAB2018	Prace badawczo-rozwojowe
Przeciwciało anty-TBR1	AB2261	Milipory
Przeciwciało anty-TBR2	ab183991	Księga Abcam
Przeciwciało anty-TUJ1	801213	Legenda biologiczna
Szkiełka nakrywkowe 24x60mm	631-1575	Firma VWR
DAPI (interfejs DAPI)	10236276001	Sigma
Surowica bydlęca płodu	A3840001	Rybak termiczny
Żelatyna ze skóry bydlęcej	Zobacz materiał G9391	Sigma
Szklany słoik do kopiowania	E94	Rybak termiczny
glicyna	MB014001	NZYtech
Monotioglicerol	Zobacz materiał M6154	Sigma
Mówił	475904	Milipory	Medium montażowe
Tryton X-100	9002-93-1	Sigma
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Zobacz materiał P1379	Sigma
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost	12372098	Rybak termiczny	Szkiełka mikroskopowe adhezyjne

powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: