$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Tworzenie organoidów mózgowych z hodowli 2D iPSC / hESC (Dzień 0)
Uwaga: Ten protokół zakłada, że utrzymanie komórek macierzystych (SC) odbywa się w pożywce do konserwacji komórek macierzystych wolnych od kseno-myszy (SCMM) z witronektyną lub substratem Geltrex. W przypadku stosowania alternatywnej, wysokobiałkowej pożywki do hodowli komórek macierzystych, zaleca się przejście kultur SC do SCMM przez co najmniej dwa pasaże przed rozpoczęciem tworzenia organoidów. Protokół nie został przetestowany z metodami hodowli SC opartymi na karmicielu.
- Stosując regularne metody konserwacji SC, doprowadź kultury do 50%-70% zbieżności. Zwykle jest to 3-4 dni po pasażowaniu, choć może to być zależne od metody hodowli i linii komórkowej.
nuta: Do wyprodukowania pełnej 96-dołkowej płytki organoidów potrzebne są około 2 dołki z płytki 6-dołkowej.
- Sprawdzaj kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu 10X-20X, aby zapewnić zdrową morfologię kolonii, bez wykrywalnego różnicowania.
- Doprowadzić SCMM do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej i rozmrozić do temperatury pokojowej fiolkę o pojemności 50 μl z 50 mM Y-27632 (inhibitorem skał) i 2 ml enzymatycznego odczynnika oddzielającego.
- Przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem U z ultra niskim nasadką (ULA), wielokanałową pipetę P200 i zbiornik na odczynnik o pojemności 25 ml.
- Podniec 45 ml SCMM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 45 μl 50 mM Y-27632. Dokładnie wymieszać przez rozcieranie.
- Odessać próżniowo dwie studzienki zawierające SC i szybko dodać 1 ml bezenzymatycznego odczynnika oddzielającego do każdej studzienki za pomocą pipety P1000. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.
- Odessać próżniowo studzienki poddane działaniu substancji i dodać 1 ml odczynnika enzymatycznego do oddzielania do każdej studzienki za pomocą pipety P1000.
- Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 5 minut.
- Usuń płytkę i zbadaj leczone studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby rozbić zagregowane komórki. Jeżeli duże skupiska komórek są nadal widoczne, inkubować płytkę przez dodatkowe 2 minuty w temperaturze 37 °C. Powtarzać ten krok do momentu, gdy skupiska przestaną być widoczne gołym okiem.
- Gdy komórki zostaną prawidłowo zdysocjowane, dodaj 1 ml SCMM do każdej studzienki, aby dezaktywować enzymy dysocjacyjne. Zebrać 4 ml zawiesiny komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i pobrać małą porcję do zliczenia komórek.
- Wszelkie pozostałe, nieoczyszczone studzienki z płytki konserwacyjnej należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Podczas liczenia odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 5 minut.
- Określ całkowitą liczbę komórek i oblicz ilość roztworu SCMM + Y-27632, która będzie potrzebna do uzyskania zawiesiny 60 000 komórek/ml.
- Ostrożnie odessać próżniowo supernatant i dodać obliczoną objętość roztworu SCMM + Y-27632. Wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml, zapewniając jednolitą zawiesinę komórek.
- Natychmiast przenieś zawiesinę komórek do zbiornika odczynnika i odpipetuj 150 μl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ULA U-bottom za pomocą wielokanałowej pipety P200. W ten sposób powstaje 96 pojedynczych organoidów, z których każdy początkowo składa się z 9 000 komórek.
- Odwirować płytkę o sile 150 x g przez 1 min.
- Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i nie naruszać płytki przez 48 godzin.
2. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 2)
- Przygotuj 17 ml SCMM z 17 μl 50 mM Y-27643 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Podgrzać roztwór SCMM + Y-27632 do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
- Wyjąć płytkę organoidową z inkubatora i za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 75 μl, powoli pobrać pożywkę z krawędzi studzienki w pierwszym rzędzie. Po pobraniu pożywki szybko wyrzuć pożywkę z powrotem do studzienki, aby podnieść luźne komórki i organoidy. Powtórz tę czynność dla każdego wiersza.
nuta: Ta technika, zwana dalej "dyspersją", podnosi szczątki komórkowe i organoid do zawieszenia. Organoid szybko opada na dno studni, podczas gdy mniejsze zanieczyszczenia pozostają w zawieszeniu, co pozwala na ich usunięcie poprzez wymianę podłoża. Pomaga to zapobiec spoczywaniu organoidu w szczątkach komórkowych podczas hodowli.
- Po rozproszeniu wszystkich studzienek odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno każdej studzienki.
- Powoli i ostrożnie odessać 75 μl pożywki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200 i dozować do zbiornika na odpady.
nuta: Większość użytkowników od czasu do czasu odsysa organoid podczas regularnych karmień. Może się to zdarzyć w około 1% przypadków. Proszę odpowiednio zaplanować, aby upewnić się, że wystarczająca liczba organoidów przetrwa do eksperymentalnych punktów czasowych.
- Przenieś roztwór SCMM + Y-27632 do zbiornika na odczynnik i dozuj 150 μl do każdej studzienki organoidowej za pomocą wielokanałowej pipety P200.
- Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
3. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 3)
- Podgrzej 17 ml SCMM do temperatury 37 °C, tym razem bez Y-27643.
- Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.
- Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany SCMM do zbiornika źródłowego.
- Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 150 μl świeżego SCMM za pomocą wielokanałowej pipety P200.
- Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
4. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 4+)
Uwaga: Przeprowadzaj tę regularną konserwację co drugi dzień, aż do infekcji.
- Przed rozpoczęciem karmienia w 4 dniu należy przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej (NI).
- Rozmrozić 250 μl podwielokrotności 2 mg/ml heparyny wraz z jedną fiolką o pojemności 5 ml z suplementem 100X N-2. Dodaj 250 μl heparyny, 5 ml 100X N-2 i 5 ml 100X Minimum Essential Medium-Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) do 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX. Sterylny przefiltrować zmieszany roztwór w filtrze o pojemności 500 ml.
Uwaga: Utrzymuj NI w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany; NI utrzymuje się do dwóch tygodni przed przygotowaniem świeżej pożywki.
- Podgrzać 17 ml pożywki NI do 37 °C.
- Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.
- Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany NI do zbiornika źródłowego.
- Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 125 μl świeżego NI za pomocą wielokanałowej pipety P200.
- Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
5. Zakażenie organoidem wirusem zika (ZIKV) (~Dzień 24)
UWAGA: Po około 3 tygodniach różnicowania, w organoidzie pojawią się duże struktury neuroepitelialne i rozety, które będą bardzo podatne na infekcję ZIKV.
- Doprowadź 1X Zrównoważony Roztwór Soli Earle'a (EBSS), 1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) i NI do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
- Rozcieńczyć ZIKV o znanym stężeniu w 1X EBSS do docelowej wielokrotności infekcji (MOI).
nuta: Zaleca się miareczkowanie różnych MOI w celu uzyskania odpowiedzi na dawkę wirusa. Może się to różnić w zależności od szczepu wirusa; dla ATCC VR-1838 i ATCC VR-1843 typowe wartości MOI mieszczą się w zakresie od 0,1 do 10).
- Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 200 μl 1X PBS do każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200, aby umyć organoidy.
- Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 50 μl roztworu 1X tylko EBSS (pozorowana infekcja) lub wirusa ZIKV do studni i upewnij się, że organoid jest całkowicie zanurzony. Powtórzyć te czynności dla każdego organoidu, który ma być zakażony na potrzeby badania.
- Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny
nuta: Inkubacja pozorowanych zakażonych organoidów przez ten czas nie powinna znacząco wpłynąć na ich wzrost w porównaniu z organoidami niezakłóconymi.
- Około 30 minut przed zakończeniem inkubacji wirusa przelać 25 ml NI do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i doprowadzić do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.
- Po zakończeniu ekspozycji na wirusa przemyj organoidy 200 μl 1X PBS dla każdej studzienki, pozwól organoidom osiąść przez 15 s, a następnie usuń 1X PBS za pomocą jednokanałowej pipety P200.
- Dodaj 200 μl świeżego NI do każdej studzienki i umieść z powrotem w inkubatorze.
- Opcjonalnie: Dla punktu czasowego dnia 0 organoidy mogą być obrazowane godzinę po zakażeniu.
- Kontynuuj hodowlę, zastępując 125 μl NI co drugi dzień metodą dyspersji (patrz krok 4). Pamiętaj, aby odpowiednio zutylizować zużyte media i końcówki, ponieważ zawierają one zakaźne cząsteczki ZIKV.