Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

Streszczenie

Źródło: Kelly, S. M., et al. Sekcja i barwienie immunofluorescencyjne ciała grzyba i neuronów fotoreceptorowych w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje szczegółowy protokół barwienia immunologicznego do wizualizacji defektów fenotypowych w ciałach grzybów zmutowanych mózgów Drosophila. Protokół polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko Fas2, białku biorącemu udział w prowadzeniu aksonów, które ułatwia prawidłowy rozwój morfologiczny i funkcjonalny ciała grzyba.

Protokół

1. Procedura utrwalania i barwienia immunofluorescencyjnego

1. Za pomocą pipety p200 przenieś wypreparowane mózgi z naczynia 9-dołkowego do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml wypełnionej 0,5 ml 4% paraformaldehydu rozcieńczonego w PTN (0,1 M bufor fosforanu sodu pH 7,2, 0,1% niejonowy środek powierzchniowo czynny). Co najmniej 10 - 15 mózgów o tym samym genotypie można połączyć w jednej probówce do mikrowirówki. Wszystkie pozostałe etapy (aż do zamontowania mózgów na szkiełkach) są zakończone w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
   ostrożność: Z paraformaldehydem (PFA) należy obchodzić się pod wyciągiem. Odpady PFA należy oszczędzać i odpowiednio utylizować. Dwadzieścia procent paraformaldehydu zakupionego w szklanych ampułkach można podzielić na mikroprobówki wirówkowe i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
2. Wewnątrz dygestorium inkubuj mózgi w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut, kołysząc się z wolną prędkością w temperaturze pokojowej.
3. Po utrwaleniu pozwól mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki pod wpływem grawitacji.
   nuta: Mózgi mogą czasami przyklejać się do boku probówki mikrowirówkowej. Jeśli tak się stanie, zwykle pomocne jest boczne obrócenie rurki między palcem wskazującym a kciukiem lub delikatne stuknięcie rurką o ławkę, aby przyspieszyć zapadanie się mózgu.
4. Usuń utrwalacz za pomocą pipety p1000 i wykonaj dwa "szybkie" płukania 500 μl PTN, pozwalając mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki między płukaniami. Podczas tych szybkich myć, gdy wszystkie mózgi osiądą grawitacyjnie na dnie probówki mikrowirówki, PTN można natychmiast wymienić na świeży bufor; Nie jest wymagany dodatkowy czas prania.
   nuta: Zazwyczaj pozostawienie dodatkowego buforu w probówce jest lepsze niż ryzyko usunięcia mózgu. Często wymagane jest dokładne zbadanie końcówki pipety, aby upewnić się, że żaden mózg nie został omyłkowo usunięty z probówki. Jeśli mózgi zostały przypadkowo odpipetowane do końcówki, należy je dozować z powrotem do probówki mikrowirówki, poczekać, aż mózgi się uspokoją, a następnie kontynuować usuwanie pozostałego PTN.
5. Po ostatnim szybkim myciu za pomocą pipety p1000 wykonaj trzy "długie" płukania: dodaj 500 μL PTN i myj przez 20 min w temperaturze pokojowej na kołysce/nutatorze. Wszystkie przyszłe "długie" prania powinny trwać 20 minut.
   nuta: Po tych praniach utrwalone mózgi mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C w PTN.
6. Usunąć ostatnie płukanie za pomocą pipety p1000 i inkubować mózgi na kołysce lub nutatorze w temperaturze pokojowej w 0,5 ml roztworu blokującego [PTN + 5% normalna surowica kozia (NGS)] przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
   1. Przeciwciała drugorzędowe kozy będą stosowane w kolejnych krokach protokołu. Jeśli stosuje się przeciwciała drugorzędowe innego gatunku, w roztworach blokujących i przeciwciał należy użyć normalnej surowicy tego gatunku (a nie NGS).
7. Za pomocą pipety p1000 usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PTN (PTN + 5% NGS + rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe). W przypadku stosowania przeciwciała pierwszorzędowego po raz pierwszy, optymalne rozcieńczenie tego przeciwciała powinno być określone empirycznie.
   nuta: Do wizualizacji neuronów ciała grzyba zwykle stosuje się przeciwciała rozpoznające Fas2. Przeciwciała te są dostępne w Banku Hybrydoma Badań Rozwojowych (DSHB) jako przeciwciało 1D4 i należy je rozcieńczyć w stosunku 1:20 w PTN + 5% NGS.
8. Inkubować mózgi w roztworze przeciwciał pierwotnych na rockerze/nutatorze przez 2 - 3 noce w temperaturze 4 °C.
9. Po inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi pozwól mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówkowej, a następnie usuń roztwór przeciwciała pierwotnego.
10. Używając pipety p1000, wykonaj 2 "szybkie" płukania i 3 "długie" 20-minutowe płukania 0,5 ml PTN, jak opisano powyżej w krokach 1.4 i 1.5, ostrożnie pozwalając, aby mózgi osiadły grawitacyjnie na dnie probówki mikrowirówki między każdym płukaniem.
11. Inkubować mózgi przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z odpowiednimi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi. Przeciwciała drugorzędowe rozcieńcza się zwykle w 0,5 ml PTN + 5% NGS w stężeniu 1:200,
    nuta: Po dodaniu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych, mózgi powinny być trzymane w ciemności do końca eksperymentu.
12. Po wtórnej inkubacji przeciwciał pozwól mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówki i usuń wtórny roztwór przeciwciała.
13. Wykonaj 2 "szybkie" płukania i 3 "długie" 20-minutowe płukania 0.5 ml PTN, jak opisano powyżej w krokach 1.4 i 1.5, ostrożnie pozwalając mózgom osiąść na dnie probówki mikrowirówkowej między każdym praniem.
14. Po trzecim "długim" 20-minutowym płukaniu użyj pipety p200, aby usunąć jak najwięcej buforu.
15. Dodaj 75 μl fluorescencyjnego podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu do mózgu. Odpipetuj mózgi i umieść podłoże w końcówce pipety raz, aby wymieszać. Nie odwracaj probówki, ponieważ mózg może utknąć na nasadce lub bokach probówki do mikrowirówki.
    nuta: Po zawieszeniu mózgów w pożywce montażowej, probówki mogą być owinięte folią aluminiową w celu spowolnienia schładzania fluoroforu i przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc. W razie potrzeby mózgi mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale najlepiej jak najszybciej zamontować je na szkiełkach.

2. Montaż mózgów dorosłych D. melanogaster na szkiełkach mikroskopowych i obrazowanie

1. Zbuduj zjeżdżalnię "mostową". Umieść dwa "podstawowe" szkiełka nakrywkowe w odległości około 1 cm od siebie na dodatnio naładowanym szkiełku. Upewnij się, że dodatnio naładowana strona zjeżdżalni jest skierowana do góry. Przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka za pomocą lakieru do paznokci, jak pokazano na rysunku 1A. Uszczelnienie trzech zewnętrznych krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci jest zwykle pomocne, aby upewnić się, że nośniki montażowe nie przesączają się pod tymi szkiełkami nakrywkowymi. Pozostaw lakier do paznokci do całkowitego wyschnięcia (10 - 15 min) przed kontynuacją.
2. Umieścić szkiełko podstawowe pod mikroskopem stereoskopowym i odpipetować roztwór podłoża mocującego zawierający wypreparowane mózgi do przestrzeni między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Aby zapewnić większy kontrast, pomocne jest manewrowanie światłami na gęsiej szyi tak, aby były równoległe do blatu.
3. Usuń dodatkowe media mocujące ze szkiełka za pomocą pipety, uważając, aby nie odpipetować mózgów z szkiełka.
4. Odsuń dodatkowe nośniki montażowe. Pozwoli to na dokładniejsze ułożenie mózgów podczas następnego kroku.
5. Używając kleszczy i mikroskopu stereoskopowego, ustaw mózgi na szkiełku w siatce z płatami czułków skierowanymi do góry.
6. Umieść szkiełko nakrywkowe ("most") na mózgach (ryc. 1A). Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka nakrywkowego mostka w miejscu, w którym stykają się z "podstawowymi" szkiełkami nakrywkowymi.
7. Za pomocą pipety p200 powoli napełnij środkową wnękę pod mostkiem świeżymi mediami montażowymi (Rysunek 1B). Umieszczaj po jednej kropli na otwartej krawędzi środkowego szkiełka nakrywkowego i pozwól, aby nośnik montażowy przesunął się pod środkową szkiełko nakrywkowe. Kontynuuj, aż cała wnęka zostanie wypełniona nośnikiem montażowym, a następnie uszczelnij górę i dół przezroczystym lakierem do paznokci
.
8. Po wyschnięciu lakieru do paznokci natychmiast zobrazuj szkiełka lub przechowuj je w światłoszczelnym, szczelnym pudełku na szkiełka w temperaturze -20 °C.
9. W ciągu tygodnia zobrazuj mózgi za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z laserami wzbudzającymi i kostkami filtrującymi odpowiednimi dla wybranych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych. Obrazy Z-stack neuronów ciała grzyba są zwykle uzyskiwane przy użyciu obiektywów 20X lub 40X.

Wyniki

Rysunek 1. Montowanie mózgów w ramach przygotowań do obrazowania immunofluorescencyjnego. (A) Mózgi są montowane na prowadnicach SuperFrost Plus z osłoną mostka, aby zapobiec spłaszczeniu mózgu. Dwa "bazowe" szkiełka nakrywkowe przykleja się do dodatnio naładowanego szkiełka SuperFrost Plus z przezroczystym lakierem do paznokci, a między nimi umieszcza się wypreparowane mózgi. Nad mózgami umieszcza ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze/pęsety do mikrodysekcji	Teda Pella	505-Mil Morskich
Dania z Sylgardu	Oprzyrządowanie systemów żywych	DD-50-S-BLK	Dostępne od amazon.com
Przeciwciało Fas2	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	1D4
Przeciwciało Chaoptin	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	Zobacz materiał 24B10
Przeciwciało GFP	Aves Lab	GFP-1010
Alexa488 koza anty-mysz przeciwciało drugorzędowe	Rybak termiczny	A-11001
Alexa488 koza anty-kurczak przeciwciało drugorzędowe	Rybak termiczny	A-11039
Alexa647 kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom	Rybak termiczny	A-21236
20% paraformaldehydu	Usługi w zakresie mikroskopów elektronowych	RT15713
VectaShield (Tarcza Vecta)	Laboratoria wektorowe	H-1000
Zjeżdżalnie SuperFrost Plus	Rybak termiczny	99-910-01
Szkiełka nakrywkowe	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 12-553-454
Na Bufor fosforanowy jednozasadowy	Sigma	Zobacz materiał S3139
Na fosforan Bufor dwuzasadowy	Sigma	Zobacz materiał S3264
Tryton X 100	Sigma	X100-100ml
lakier do paznokci	Usługi w zakresie mikroskopu elektronowego (EMS)	Numer telefonu 72180
mikroskop stereoskopowy	Leica S6D ze źródłem światła LED KL300
Naczynie 9-dołkowe (talerz punktowy)	Firma VWR	Numer katalogowy: 89090-482
nutator/wahacz	rybak	22-363-152 lub 88-861-041
Talerz 35mm	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	rybak	50-366-794
Kimwipe (Domyfikacja)	rybak	Numer katalogowy: 06-666
Potencjalne fiksacyjne
Bufor PTN			0,1 M NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, zwykle uzupełniać 0,5 l 0,1 M buforu NaPhosphate i porcjować 50 ml na raz w razie potrzeby
Fly Stocks dostępne w Bloomington
elav (c155)-GAL4		BL458	Pan-neuronalny sterownik GAL4
w*;;; OK107-GAL4		BL 854	Sterownik GAL4 dla wszystkich neuronów ciała grzyba (insercja OK107-GAL4 znajduje się na 4. chromosomie)
y(1), w(67c23); c739-GAL4		BL 7362	Sterownik GAL4 dla płatów alfa i beta (na 2. chromosomie)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64305	Sterownik GAL4 dla płatów alfa i beta, zawiera również UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	Sterownik GAL4 przede wszystkim dla płatów gamma ciała grzyba (na 2. chromosomie)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, bezzałogowy statek powietrzny-CD8-GFP		BL 64296	Sterownik GAL4 dla płatów gamma ciała grzyba, zawiera również UAS-CD8-GFP

TGL (wersja angielska) powiedział: powiedział: