Wywoływanie zapalenia nerwów u larw danio pręgowanego za pomocą wstrzyknięcia lipopolisacharydu

Streszczenie

Źródło: He, Y. et al. Mikroiniekcje lipopolisacharydu w komorze mózgu do larw danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności. J. Vis. Exp. (2022).

Film demonstruje mikrowstrzykiwanie lipopolisacharydów (LPS) do mózgów larw danio pręgowanego w celu wywołania zapalenia nerwów. Larwy umieszcza się na naczyniu wyłożonym agarozą, igłę wprowadza się do komór mózgu i wstrzykuje się LPS. Wstrzyknięty LPS wywołuje odpowiedź immunologiczną, która prowadzi do zapalenia nerwów.

Protokół

1. Przygotowanie do mikroiniekcji

1. Przygotować się do wstrzyknięcia, pobierając szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z pięcioetapowym protokołem pobierania szklanej rurki kapilarnej (Tabela 1).
2. Otwórz końcówkę igły (cienkościenne szklane kapilary [3,5 cala] z filamentem, średnica zewnętrzna [OD] 1,14 mm) do odpowiedniego rozmiaru pod odpowiednim kątem za pomocą kleszczyków (Rysunek 1A).
3. Napełnij igłę 0,1 ml oleju mineralnego, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków.
4. Zdjąć nakrętkę ze stalowej igły aparatu do mikroiniekcji. Dopasuj szklany otwór na igłę do stalowej igły, a następnie dokręć nakrętkę. Zamontować załadowany aparat do mikroiniekcji igłowej w mikromanipulatorze (patrz Tabela Materiałów).
5. Dostosuj położenie aparatu do mikroiniekcji tak, aby mikromanipulator mógł elastycznie przesuwać aparat pod mikroskopem. Wypuścić pewną objętość oleju parafinowego, aby stalowa igła weszła do szklanej rurki kapilarnej.
6. Upuść roztwór do wstrzykiwań (taki jak 1× soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub 5 mg/ml LPS) na szkiełko podstawowe wysterylizowane 70% etanolem i wyreguluj aparat do mikroiniekcji tak, aby końcówka została włożona do kropli cieczy. Do igły wsypać ~2 μl roztworu do wstrzykiwań.
7. Ustawić mikromanipulator (precyzyjne ustawienia regulacji: góra, dół, lewo i prawo) tak, aby końcówka igły aparatu do mikroiniekcji znajdowała się w tym samym polu widzenia, co larwy w dużym powiększeniu (ryc. 1B).

2. Montaż danio pręgowanego do mikroiniekcji

UWAGA: Rozwój mózgu danio pręgowanego następuje w ciągu 3 dni po zapłodnieniu (dpf) i dojrzewa w wieku 5 dpf z dobrze rozwiniętym ośrodkowym układem nerwowym. Dlatego 5 larw dpf nadaje się już do badania uszkodzeń neuronów za pośrednictwem LPS, a także reakcji behawioralnych i zapalnych.

1. Wstrzyknąć larwy danio pręgowanego w ciągu około 30 minut od osiągnięcia etapu zainteresowania, aby utrzymać stały czas wstrzyknięcia.
2. Aby znieczulić larwy danio pręgowanego, połącz tricainę z czystą wodą w akwarium (końcowe stężenie 0,02% w/v tricainy).
3. Rozpuść roztwór 2% agarozy w wodzie podwójnie destylowanej (_ddH2O) za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wlej stopioną agarozę do plastikowego naczynia. Naczynie z tworzywa sztucznego pokrytego 2% agarozą można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
4. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować znieczulone larwy do środka plastikowego naczynia pokrytego 2% agarozą. Ustaw zamontowane larwy stroną z mózgiem do góry, aby uzyskać dostęp do igły.

3. Wstrzykiwanie do komory mózgu

1. Dostosuj powiększenie mikroskopu tak, aby struktura komory mózgowej danio pręgowanego była wyraźnie widoczna w polu widzenia (ryc. 1B).
2. Ostrożnie umieść igłę nad rdzeniem mózgu (ryc. 1C).
3. Powoli nakłuj skórę mózgu danio pręgowanego końcówką igły za pomocą mikromanipulatora.
4. Naciśnij pedał nożny, aby wysunąć 1 nL 1x PBS lub różnych stężeń LPS (1.0, 2.5 i 5.0 mg/mL) (patrz Tabela materiałów). Jako przykład przedstawiono udane obrazy wstrzyknięcia komory, w których do komory mózgu wstrzyknięto 1 nL 1% niebieskiego barwnika Evansa (rozcieńczonego w PBS) (ryc. 1D). Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść larwy na czyste podłoże z wodą z jaj (E3). Po 24 godzinach zbierz larwy do obrazowania mikroskopowego, testu behawioralnego lokomotywy i określenia innych wskaźników.

Wyniki

Tabela 1: Pięcioetapowy protokół pobierania szklanej rurki kapilarnej.

krok	Czas pracy (s)	Poziom ciepła	akcja
T1	L>	H80-89	Zobacz materiał P1L005
Klasa T2	1,6-3	Godzina ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarozy	Sigma-Aldrich	Ciągnik siodłowy A6361
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma-Aldrich	Nr kat. A9414
Programowalny wtryskiwacz nanolitrowy Drummond Nanoject III	Drummond Scientific	Numer telefonu 3-000-207
Stereoskopowe mikroskopy fluorescencyjne	Księga Leica	M205 FA
Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Mikromanipulator ręczny	Światowe instrumenty precyzyjne	Zobacz materiał M3301
olej mineralny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5904
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4417
Cienkościenne szklane kapilary (4") z żarnikiem, średnica zewnętrzna 1,5 mm	Światowe instrumenty precyzyjne	TW150F-4
Trikaina (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego)	Sigma-Aldrich	A-5040