Modelowanie śmierci neuronalnej wywołanej reaktywnymi gatunkami tlenu w neuronach ziarnistych móżdżku myszy

1. Przygotowanie do eksperymentu

UWAGA: Następujące roztwory podstawowe mogą być przygotowywane i utrzymywane aż do użycia.

1. Rozwiązanie do rozwarstwiania
   1. Rozpuścić 3,62 g chlorku sodu (NaCl), 0,2 g chlorku potasu (KCl), 0,069 g fosforanu sodu (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) i 1,306 g D-(+)-glukozy w 500 ml destylowanego_H2O. Następnie do roztworu dodać 12,5 ml buforu HEPES, 450 μl roztworu czerwieni fenolowej i 20 ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) frakcji V. Dostosować do pH 7,4 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH).
   2. Sterylizować filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie pozostanie stabilne przez okres od tygodnia do 10 dni.
2. trypsyna
   1. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 25 g/l trypsyny w 0,9% chlorku sodu. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
3. Inhibitor trypsyny
   1. Przygotować bulion o stężeniu 10 mg/ml, rozpuszczając 1 g inhibitora trypsyny białka jaja kurzego w 100 ml 1 mM HCl. Przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C.
4. Deoksyrybonukleaza (DNaza)
   1. Rozpuść 100 mg DNazy 1 w 10 ml sterylnej wody, aby uzyskać zapas 10 mg/ml. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
5. MgSO₄
   1. Dodać 6,02 g siarczanu magnezu (_MgSO4) do 50 ml wody destylowanej (_H2O), aby uzyskać 1 M zapas. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
6. CaCl₂
   1. Rozpuścić 0,735 g chlorku wapnia (CaCl₂∙ 2H₂O) w 50 ml destylowanego_H2Odo stężenia podstawowego 100 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
7. Kcl
   1. Rozpuścić 3,7275 g KCl w 50 ml destylowanego_H2Odo stężenia podstawowego 1 M. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
8. D-(+)-glukoza
   1. Rozpuścić 1,802 g D-(+)-glukozy w 50 ml destylowanego_H2Odo stężenia podstawowego 100 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
9. Pożywki do hodowli komórkowych
   1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych w następujący sposób: 5 ml inaktywowanej termicznie dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 500 μl 200 ml L-glutaminy, 100 μl 50 mg/ml genttamycyny i 1 ml 1,0 M KCL należy dodać do 45 ml wysterylizowanej filtrem minimalnej niezbędnej pożywki Eagle'a (E-MEM), która jest uzupełniona 1,125 g / l D-glukozy w celu wytworzenia 50 ml pożywki hodowlanej neuronów ziarnistych móżdżku (CGN). Przechowuj nośniki w temperaturze 4 °C.
10. Cytozyna Beta-D-Arabino Furanoside
    1. Rozpuścić 48 mg beta-D-arabino furanozydu cytozyny w 10 ml pożywki wzrostowej do stężenia podstawowego 20 mM. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
11. Poli-D-lizyna
    1. Aby wytworzyć zapas poli-D-lizyny o stężeniu 2 mg/ml, dodaj 10 ml sterylnego_H2Odo 20 mg poli-D-lizyny. Zapas poli-D-lizyny należy przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl podwielokrotności.
       nuta: Następujące roztwory należy przygotować przed rozbioru i utrzymywać w temperaturze 4 °C aż do użycia.
12. MgSO₄ Uzupełniony roztwór preparacyjny
    1. Dodać 300 μl wywaru_MgSO4 do 250 ml roztworu rozwarstwiającego.
13. Roztwór do rozwarstwiania trypsyny
    1. Dodać 100 μl trypsyny i 12 μl MgSO 4 do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
14. Roztwór inhibitora trypsyny 1
    1. Dodać 164 μl podstawowego inhibitora trypsyny, 250 μl podstawowej DNazy 1 i 12 μl podstawowego MgSO₄ do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
15. Roztwór inhibitora trypsyny 2
    1. Dodać 1040 μl podstawowego inhibitora trypsyny, 750 μl podstawowego inhibitora DNazy 1 i 12 μl podstawowego MgSO,₄ do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
16. CaCl₂ uzupełniony roztwór preparacyjny
    1. Dodać 10 μl podstawowego CaCl₂ i 25 μl podstawowego MgSO₄ do 10 ml roztworu rozwarstwiającego.
17. Naczynia hodowlane pokryte poli-lizyną
    1. Aby pokryć szalki hodowlane, rozcieńczyć 100 μl bulionu poliD-lizyny w 40 ml sterylnego_H2O. W przypadku szalek do hodowli Nunc o średnicy 35 mm dodaj 2 ml rozcieńczonego roztworu poli-D-lizyny. W przypadku płytek 4dołkowych dodać 300 μl rozcieńczonej poli-D-lizyny do każdej studzienki.
    2. Pozostaw poli-D-lizynę na 1 godzinę przed zasysaniem i umyciem każdej studzienki 4 ml lub 600 μl (odpowiednio dla szalek hodowlanych 35 mm lub 4 dołków) sterylnego H₂O. Następnie zassać_H2Oi pozostawić naczynia do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę.

2. Ekstrakcja mózgu i izolacja móżdżku

1. Odetnij głowę 6-7-dniowemu szczeniakowi myszy za pomocą nożyczek do dekapitacji. Wykonaj sekcję mózgu w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
2. Aby usunąć mózg, chwyć głowę za pomocą kleszczy i przetnij skórę w kierunku przedniej części głowy za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, jak pokazano na rycinie 1. Następnie przetnij kość czaszki za pomocą nowej pary nożyczek, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Usuń czaszkę zakrywającą mózg za pomocą kleszczy i wydłub mózg za pomocą kleszczy lub szpatułki.
   1. W razie potrzeby przeciąć nerw wzrokowy, aby ułatwić wydostanie mózgu jako całości.
3. Umieść mózg w roztworze preparacyjnym, który jest uzupełniany MgSO₄. Utrzymuj roztwór i mózg na lodzie.
4. Po usunięciu mózgu, pod mikroskopem preparacyjnym, wypreparuj móżdżek z mózgu, będąc jeszcze w roztworze preparacyjnym uzupełnionym MgSO₄, i usuń opony mózgowe za pomocą cienkich kleszczy. Obróć móżdżek na jego brzuszną stronę i zapewnij usunięcie splotu naczyniówkowego.
5. Umieść móżdżek w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym ~ 1 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego MgSO₄
.
6. Pokrój tkankę na małe kawałki i przenieś do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml buforowanego roztworu preparacyjnego_MgSO4
.

3. Izolacja i hodowla neuronów granulatu móżdżku myszy

1. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml zawierającą rozdrobnioną tkankę mózgową przez 5 minut w temperaturze 644 x g i temperaturze 4 °C.
2. Usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml roztworu do rozwarstwiania trypsyny. Następnie wstrząsać probówką na wysokich obrotach przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj 10 ml roztworu inhibitora trypsyny 1 do probówki i delikatnie kołysz przez 2 minuty.
4. Wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 644 x g i temperaturze 4 °C.
5. Usunąć supernatant i dodać 2 ml roztworu inhibitora trypsyny 2, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
6. Rozcierać tkankę w probówce o pojemności 15 ml, aż roztwór stanie się mętny. Następnie odstaw na 5 minut.
7. Usunąć klarowny supernatant i przenieść go do nowej probówki zawierającej 1 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego CaCl₂.
8. Dodać kolejny ml roztworu inhibitora trypsyny 2 na dno probówki zawierającej osad z kroku 3.6. Ponownie rozetrzeć i odstawić na 5 minut. Usunąć supernatant i dodać go do probówki zawierającej supernatant z kroku 3.7 (jest to powtórzenie kroków 3.6-3.7). Powtarzaj ten proces, aż większość tkanki zostanie mechanicznie zdysocjowana.
9. Dodać 0,3 ml roztworu rozwarstwiającego uzupełnionego CaCl₂ do zbioru supernatantu na każdy ml supernatantu.
10. Wymieszać zawartość probówki, a następnie wirować przez 5 minut przy 644 x g.
11. Usunąć sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do osadu i wymieszać.
12. Komórki można następnie policzyć i rozcieńczyć do stężenia 1,5 x 10⁶ komórek/ml. Należy pamiętać, że ogólnie oczekuje się, że z każdego wypreparowanego mózgu oczekuje się 10 milionów komórek, w zależności od czasu trypsynizacji i skuteczności sekcji. Ogniwa płytkowe na wcześniej wykonanych płytkach poli D-lizynowych. W przypadku płytek 4-dołkowych płytka 0,5 ml, co daje 7,5 x 10⁵ komórek na dołek. W przypadku szalek 35 mm talerz 4 ml, co daje 6 x 10⁶ komórek na płytkę.
13. Po 24 godzinach dodać do płytek cytozyno-β-arabino furanozyd (AraC) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia glejowego. Na każdy ml pożywki wymagane jest 0,5 μl z 20 mM AraC. Dodanie AraC nie wymaga zmiany nośnika. Jeśli komórki mają być utrzymywane przez 7-8 dni, powtórz ten zabieg w 3 dniu.
14. Utrzymywać kultury w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C i karmić 100 μl 100 mM glukozy dodawanej do kultury na każde 2 ml pożywki co 2 dni po 5 dniach. Całkowita zmiana nośnika nie jest wymagana.

4. Modelowanie uszkodzeń neuronalnych

1. Aby wywołać śmierć komórki indukowaną przez ROM (stres oksydacyjny), potraktuj neurony nadtlenkiem wodoru o stężeniu 75-100 μM (_H2O2) i przełącz się na kondycjonowane pożywki z równoległych kultur po 5-minutowej ekspozycji na_H2O2. Uwaga, ze względu na niestabilność_H2O2, zoptymalizuj stężenie do poziomu, który indukuje 50-70% śmierć komórki w hodowli po 24 godzinach leczenia (Figura 2).

Rycina 1: Usunięcie mózgu myszy i wypreparowanie móżdżku. (A) Aby wydobyć mózg 6-7-dniowej myszy, za pomocą kleszczy chwyć głowę i przeciąć skórę z przodu wzdłuż przerywanych linii za pomocą nożyczek do mikrodysekcji. Uważaj, aby przeciąć tylko skórę i tkankę łączną, zbyt głębokie nacięcie może przebić czaszkę i uszkodzić mózg. Te trzy nacięcia, proste wzdłuż linii środkowej i dwa zakrzywione na boki, pozwalają na odsunięcie skóry odsłaniając czaszkę. Po odsłonięciu czaszkę można przebić czubkiem nożyczek i przeciąć do przodu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić móżdżku, aby ułatwić identyfikację i usunięcie opon mózgowych. Po przecięciu kleszcze mogą być użyte do odklejenia czaszki, odsłaniając mózg, który można następnie przelać do chłodnego roztworu preparacyjnego za pomocą kleszczy lub szpatułki. W celu usunięcia mózgu może być konieczne przecięcie nerwu wzrokowego. (B) Po wyjęciu z czaszki, opony mózgowe powinny zostać usunięte z móżdżku za pomocą pary kleszczy z cienką końcówką. (C) Za pomocą pary kleszczy z cienką końcówką móżdżek jest wycinany z pozostałej tkanki i sprawdzany w celu zapewnienia całkowitego usunięcia opon mózgowych.

Rycina 2: Modelowanie uszkodzenia neuronów w neuronach ziarnistych móżdżku. Izolowane móżdżek od 6 do 7 dnia myszy są dysocjowane na pojedyncze komórki zgodnie z procedurą przedstawioną w części 3. Po dysocjacji komórki są zliczane i ponownie zawieszane w objętości pożywki hodowlanej, aby wytworzyć 1,5 x 106 komórek/ml. W przypadku szalek o średnicy 35 mm plateruje się 4 ml, co daje 6 x 106 komórek na płytkę. W przypadku szkiełek do obrazowania plateruje się 0,5 ml, co daje 7,5 x 105 komórek/dołek. CGN mogą być następnie transdukowane lentiwirusem lub zakażone adenowirusem. Użycie adenowirusa w dniu posiewu (0 dni in vitro (DIV)) daje ponad 90% skuteczność transfekcji i pozwala na badanie uszkodzeń neuronów poprzez stres oksydacyjny i uszkodzenie DNA. Dodanie 10 μM kamptotecyny (CPT) wywoła uszkodzenie DNA, podczas gdy 75-100 μM nadtlenku wodoru (H2O2) wywoła stres oksydacyjny. StężenieH2O2musi być zoptymalizowane, aby wywołać 50% śmierć komórki po 24 godzinach. Zakażenie adenowirusami w 5 DIV daje niższą skuteczność transdukcji poniżej 10%. Przy 7 DIV, gdy receptory NMDA są wzbogacone w hodowli, neurony można traktować 100 μM NMDA i 10 μM glicyną w celu wywołania ekscytotoksyczności. Jest to idealne rozwiązanie do późniejszej analizy obrazowej lub śledzenia pojedynczego neuronu. Wreszcie, transdukcja lentiwirusem w 0 DIV, a następnie traktowanie 100 μM NMDA i 10 μM glicyną w 7 DIV, daje wystarczająco wysoką wydajność transdukcji (>80%), aby umożliwić analizę biochemiczną hodowli, w tym sekwencjonowanie ChIP, badanie ekspresji białek i wykonywanie testów żywych/martwych.