$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Immunohistochemia
- Barwienie analogiem tymidyny
- Umieść skrawki tkanki w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i zamontuj 5-8 odcinków na dodatnio naładowanym szkiełku, zachowując kolejność szeregową od przodu do tyłu i tę samą orientację. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia, aby całkowicie przylegały do szkiełek, a następnie narysuj granicę za pomocą pisaka hydrofobowego lub pisaka PAP.
- Skrawki przepuszczalne z buforem permeabilizacyjnym (0,5% TBS (tris buforowana sól fizjologiczna) -tryton) przez 20−30 min. Następnie umyj sekcje 2x przy użyciu TBS-tryton przez 5 min każda.
UWAGA: Permeabilizacja wspomaga wewnątrzkomórkową penetrację przeciwciał. Czas przepuszczalności można dostosować w zależności od grubości tkanki i wydajności przeciwciał. Alternatywnie można zwiększyć stężenie detergentu, aby zwiększyć siłę przepuszczalności. Należy jednak uważać, aby nie przenikać zbyt długo, ponieważ kruchość tkanek wzrasta wraz z wydłużonym czasem przepuszczalności.
- Przygotować roztwór reakcyjny Edu (5-etynylo-2'-deoksyurydyna) zgodnie z tabelą 1. Końcowe stężenie azydku Alexa488 wynosi 15 μM w 1 ml roztworu reakcyjnego Edu.
- Inkubować skrawki w roztworze reakcyjnym Edu przez 30 min do 1 h, a następnie myć 3x w TBS-tryton przez 5 min każda. Po tym kroku przykryj szkiełka folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Na tym etapie sprawdź, czy reakcja Edu przebiega za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Komórki znakowane edu będą fluoryzować pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
- Protokół zamontowanego wycinka tkanki
- Blokować skrawki tkanek zamontowane na szkiełku z kroku 1.1.4 za pomocą buforu blokującego wyhodowanego u tych samych zwierząt co przeciwciało drugorzędowe, np. surowica osła, przez 30 minut do 1 godziny, a następnie przemywać 2x w TBS-tryton przez 5 minut każdy.
- Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (tj. anty-nestyny kurzej) podczas etapu blokowania, mieszając przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze buforowym blokującym w stosunku 1:200. 250 μl na szkiełko jest wystarczające, aby zapewnić, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze.
- Skrawki tkanek inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze pokojowej po zablokowaniu płukania. Zmodyfikuj ten krok w zależności od użytego przeciwciała pierwszorzędowego.
nuta: Jeśli przeciwciała mają wysokie tło lub niespecyficzne wiązanie, inkubacja w temperaturze 4 °C zamiast RT (temperatura pokojowa) może poprawić wyniki. W razie potrzeby przeciwciała o słabej penetracji tkanek można pozostawić do inkubacji na 2 dni.
- Inkubować skrawki tkanek 3x w TBS-tryton przez 5 minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych. Następnie inkubować skrawki tkanek w przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem (np. Alexa 647 anty-kurczak w stosunku 1:200) przygotowanych w blokującym roztworze buforowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki tkanek 3x w TBS-tryton przez 5 minut w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał drugorzędowych i zastosować 300 μM roztworu DAPI (4′,6-diamidyn-2-fenyloindol) w stosunku 1:100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubuj skrawki tkanek 3 razy w PBS przez 5 minut, aby usunąć nadmiar DAPI i usuń krąg pisaka z okolic tkanki za pomocą bawełnianego wacika lub delikatnej chusteczki do zadań. Pozostaw sekcje do wyschnięcia, a następnie nałóż media montażowe i szkiełko nakrywkowe. Poczekaj, aż nośnik montażowy wyschnie przed użyciem szkiełek do obrazowania.
Tabela 1: Roztwory stosowane w immunohistochemii
| Roztwór przeciw zamarzaniu | Glikol etylenowy 150 ml + sacharoza 150 g + napełnienie do 500 ml 0,1 M PB na 500 ml roztworu |
| Bufor cytrynianowy | 9 ml bulionu kwasu cytrynowego + 41 ml buforu cytrynianu trisodu + 450 ml ddH2O |
| Bulion z kwasu cytrynowego | [0,1 m] Kwas cytrynowy 21 g/1 l ddH2O |
| Zapas cytrynianu trisodowego | [0,1 m] Cytrynian trisodowy 29,4 g/1 l ddH2O |
| Tris Buforowana sól fizjologiczna -Tryton (TBS -Tryton) | 0,05% 100-x Tryton w TBS |
| Bufor przepuszczalności | 0,5% 100-x Tryton w TBS |
| Bufor blokujący | 0,33 ml osła w 10 ml TBS-Triton |
| Rozwiązanie reakcyjne Edu | Przygotować roztwór CuSO4·5H2O, dodając 1 mg CuSO4·5H2O w 4 ml roztworu o [0,1 M] Tris pH 8,5. Następnie dodać 1:40 600 μM roztworu azydku Alexa488 i 10 mg/ml askorbinianu L-Na+ do roztworu CuSO4·5H2O przed nałożeniem go na tkankę. |